DNA粗提取與鑒定實驗ppt課件.ppt

1、DNA粗提取與鑒定實驗,1,內(nèi)容,一、課題分析,1.教學(xué)目標 （1）分析DNA的性質(zhì)及提取的基本思路。 （2）探究不同手段提取DNA的實驗過程。 （3）掌握DNA提取的過程并靈活運用。,2.背景描述 生物體的性狀之所以能夠遺傳給后代，是由于其體內(nèi)具有DNA或RNA這些遺傳物質(zhì)，DNA是遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過實驗證實。 那么DNA究竟什么樣？ 本課題通過嘗試對植物或動物組織中的DNA進行粗提取，了解DNA的理化性質(zhì)，理解DNA提取以及鑒定的原理，在一定層面感性認知DNA。,一、課題分析,一、課題分析,dAMP,dTMP,dCMP,dGMP,胸腺嘧啶,腺嘌呤,鳥嘌呤,5,核苷酸結(jié)構(gòu),6,一、課題分析,脫

2、氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。,7,一、課題分析,讀取密碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄。 是以DNA雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱為mRNA（信使RNA）的核酸分子。 多數(shù)RNA帶有合成蛋白質(zhì)的訊息，另有一些本身就擁有特殊功能，例如rRNA、snRNA與siRNA。,8,一、課題分析,在細胞內(nèi)，DNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng)稱為染色體組。 人正常的人體細胞中含有46條染色體。,染色體在細胞分裂之前會先在分裂間期完成復(fù)制

3、，細胞分裂間期又可劃分為：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。,9,一、課題分析,DNA是高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基綠染成綠色。 DNA對紫外線（260nm）有吸收作用，利用這一特性，可以對DNA進行含量測定。 當核酸變性時，吸光度升高，稱為增色效應(yīng)；當變性核酸重新復(fù)性時，吸光度又會恢復(fù)到原來的水平。 較高溫度、有機溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子變性，即DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開也稱為DNA的解螺旋。,10,洋蔥內(nèi)表皮細胞DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色,11,二、教學(xué)建議,科學(xué)的

4、探究一般過程為“發(fā)現(xiàn)問題提出假設(shè)設(shè)計實驗預(yù)測結(jié)果得出結(jié)論”。 通過本實驗的設(shè)計的具體的實施，是學(xué)員能夠接受科學(xué)的訓(xùn)練，在訓(xùn)練過程中舉一反三，從理論到實踐認知DNA的提取過程和操作原理。 從DNA的物質(zhì)組成，到DNA的復(fù)制時期，聯(lián)系生物學(xué)現(xiàn)象。在理解DNA的理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用其理化性質(zhì)對DNA進行分離。,12,三、材料器具,材料：新鮮菠菜4kg。 試劑：氯化鈉1000g、SDS 500g、無水乙醇4000ml、二苯胺200ml。 器材：200ml燒杯60個、試管100支、研缽30個、玻璃棒30個、紗布2包、不銹鋼藥勺30個、濾紙5包。 儀器：天平2臺、水浴鍋2個、漏斗30個。,13,DNA是

5、大分子高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度。DNA對紫外線有吸收作用，當核酸變性時，吸光值升高； 當變性核酸可復(fù)性時，吸光值又會恢復(fù)到原來水平。溫度、有機溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以引起DNA分子變性，即使得DNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開。,四、實驗理論基礎(chǔ),14,1、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響； 大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上才會變性； 洗滌劑可以溶解細胞的細胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對DNA沒有影響。,四、實驗理論基礎(chǔ),15,2、DNA的溶解度 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaC

6、l溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反。,四、實驗理論基礎(chǔ),3、DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。,16,1、實驗材料的選取 凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，更具有操作性，根據(jù)實驗?zāi)康倪x取適當?shù)牟牧虾头椒ā?魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。,五、實驗操作原理,17,2、細胞破碎 動物細胞：沒有細胞壁破碎較易，例如，在雞血細胞液中加入

7、一定量的蒸餾水 ，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。 原理：蒸餾水對于細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。 植物細胞：需要先用一定的洗滌劑和氯化鈉溶解細胞膜，洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放，氯化鈉有利于DNA的溶解。 研磨：使DNA充分釋放，洗滌劑等更容易充分接觸細胞膜。用液氮研磨可有效的防止DNA降解。,五、實驗操作原理,18,2、細胞破碎 DNA降解的原因： 溫度：高溫,易加速磷酸二酯鍵的水解。 濕度：參與磷酸二酯鍵的水解 、影響DNA螺旋的形成結(jié)構(gòu)。

8、 pH值：氫離子參與與催化磷酸二酯鍵的水解 、過高或過低的pH值都易破壞氫鍵 。 氧化反應(yīng)：氧化堿基中的含氮雜環(huán),使其變性,從而進一步改變一級與二級的DNA構(gòu)象。 DNA降解酶：水解DNA。,五、實驗操作原理,19,3、DNA的純化 細胞破碎后主要含有蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)?？筛鶕?jù)DNA的性質(zhì)進行純化。首先可通過過濾、離心等方法去除不溶解的雜質(zhì)，然后再進一步純化。 氯化鈉中的溶解度，氯化鈉濃度為2mol/l時DNA溶解度最大，可在此濃度下先溶解DNA，然后過濾去除不溶解的雜質(zhì)，然后在DNA溶解度最低的氯化鈉溶液中（0.14mol/l）使DNA析出，再過濾去除溶解在氯化鈉溶液中的雜質(zhì)。,五、實

9、驗操作原理,20,3、DNA的純化 利用蛋白酶降解蛋白質(zhì)，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K等，降解蛋白質(zhì)。 適當溫度降解蛋白質(zhì)，65-70，DNA不會被變性，蛋白會變性。 不溶于水的有機溶劑，酚、氯仿等，DNA不溶于這類試劑，蛋白質(zhì)可溶解在其中，通過靜止或離心使有機試劑和水分離，去除雜質(zhì)。 DNA結(jié)合柱，硝酸纖維素膜等，在酸性條件下可結(jié)合DNA，中性和堿性條件下結(jié)合能力差。通過DNA的等電點調(diào)節(jié)其所帶電荷為正電或負電，通過孔徑去除大分子和小分子。,五、實驗操作原理,21,4、DNA的析出 溶于水的有機溶劑可使DNA析出，水更容易和有機試劑結(jié)合，使DNA析出，如一定濃度乙醇、異丙醇（乙醇濃度一

10、般在48-67.5%，異丙醇濃度在36%以上，濃度越高效果越好），低溫效果更好（雜質(zhì)較多），同時，可在一定程度上出去溶于該有機試劑的雜質(zhì)。 5、DNA的溶解 一般采用TE（Tris-EDTA，pH8.0）緩沖液或去離子水。,五、實驗操作原理,22,6、 DNA的鑒定 DNA與二苯胺（沸水?。境伤{色； 可被甲基綠染成綠色； DNA對紫外線（260nm）有吸收作用； DNA可與溴化乙錠（EB）花青素類染料結(jié)合，可在紫外光下激發(fā)熒光。,五、實驗操作原理,23,1.植物材料的研磨：稱取新鮮植物材料（菠菜）100g，表面清洗后，在研缽中充分研磨，可加入石英砂，將植物組織充分研磨（可加入適量的提取緩沖液）。 2.將研磨好的樣品取出置于200ml燒杯中，加入100ml 10%的SDS輕輕混勻，65水浴10-15min后取出。 3.用多層紗布過濾，含DNA的粘稠物留在紗布上。 4.用20mL 2mol/L的NaCl溶液，溶解粘稠物，在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,六、實驗步驟,24,5. 用放有兩層紗布的漏斗過濾，濾液中含有DNA。 6. 向濾液中加入等體積的無水乙醇（或95%的乙醇），用玻棒沿一個方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀