酵母各種雜交.ppt

1、酵母雜交技術,2016-7,相關知識： 1、順式作用元件：存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列。包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，作用是參與基因表達的調控。 2、反式作用因子（轉錄因子）：能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上，參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質。 3、報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因。,4、cDNA文庫：以mRNA為模板，反轉錄合成雙鏈cDNA ，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。,基本原理,真核生長轉錄因子含有兩個結構上可以分開的、功能上也相互獨立的結構域組成的結

2、構域：,轉錄激活結構域(AD) (activation domain),DNA結合結構域(BD) (DNA binding domain),轉錄激活因子,BD：識別DNA上特定序列，轉錄激活域定位調控 基因的上游。 AD：與轉錄復合體其他成分作用，從而啟動所調節(jié)基因的轉錄。,兩個結構域分開時仍具有功能，但不能激活轉錄，只有他們以適當 途徑在空間上相互靠近時，才能具有轉錄因子活性，激活報告基因的表達。 酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報告基因的表達，探測蛋白-蛋白的相互作用。,DNA結合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸,可識別并結合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(UAS) 。 轉錄激活域

3、（AD）：C端786-881氨基酸,通過同轉錄機制的其它成分之間的結合以啟動上游激活序列（UAS）下游的基因轉錄。,酵母轉錄因子GAL4結構特點,酵母雙雜交步驟,1、構建質粒（誘餌蛋白不發(fā)生自激活） 2、轉化酵母細胞（本身不表達GAL4） 3、陽性篩選,1.（1）BD-plasmid 靶基因(蛋白A基因)按正確的讀碼結構和取向克隆在GAL4的BD之后。 篩選標志：TRP,（2）AD-plasmid 蛋白B基因按正確閱讀框 克隆到GAL4的AD片斷 之后。 篩選標志：LEU2,（1）雙載體轉化能合成亮氨酸和色氨酸。,Trp-,Leu-,2. 兩種重組質粒共同轉化酵母菌（HF7c） 3.篩選觀察,

4、（2）篩選蛋白A和蛋白B能相互作用的雙載體轉化子。,Trp-,Leu-,His-,酵母細胞,cDNA文庫,誘鉺蛋白基因,多克隆位點,DNA-BD 載體,AD 載體,轉化,轉化,酵母細胞,篩選平板生長菌苔,篩選平板生長菌苔,同一個三重篩選平板,克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）,鑒定,-半乳糖苷酶,酵母雙雜交系統(tǒng)的應用：,（1）發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能 （2）研究抗原和抗體的作用（細胞內(nèi)） （3）檢測已知蛋白質之間的相互作用 （4）確定未知蛋白之間的相互作用 （5）確定基因治療中多肽類藥物的作用機理,應用舉例,應用酵母雙雜交篩選與 FAM172A相互作用蛋白的研究,實驗步驟：,（1）誘餌質粒構建： 擴

5、增誘餌蛋白基因 與質粒載體連接 重組載體鑒定 誘餌蛋白自我轉錄激活檢測：將誘餌質粒轉入酵母菌株，若轉化了誘餌質粒的酵母菌落表達-半乳糖苷酶，則可使底物X-Gal 變藍，說明存在自激活（假陽性），否則無自激活。,（2）人胎腦cDNA質粒構建,（3）酵母雙雜交篩選人胎腦 cDNA 文庫 人胎腦 cDNA文庫轉化誘餌酵母菌及初步篩選: 菌液，分別涂布于培養(yǎng)基（A：Leu-/Trp-、B: Leu-/Trp- /His-），A平板上的克隆進行計數(shù)，根據(jù)稀釋度計算轉庫效率（轉庫效率只有達到 1X107-1X108cfu/gDNA以上才能進行文庫的篩選，以保證不會丟失陽性克隆 半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗進

6、一步篩選: 從B: Leu-/Trp- /His-平板上挑取 35 個單克隆進行 -半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗，變藍色的為陽性克隆。,（3）陽性雜交克隆的質粒抽提及一對一驗證: 對上述篩選的陽性克隆進行質粒抽提，再次進行抗性篩選和質粒抽提后，一對一與誘餌質粒 p GB-FAM172A共轉酵母細胞 Y190 驗證。 （4）再次陽性者抽提質粒進行測序及生物信息學分析: 利用 NCBI 對測序所得到的序列進行 BLAST 比對分析。,結果,對 10個陽性克隆相應的質粒進行測序后，通過 BLAST在 GenBank數(shù)據(jù)庫中對應 6個不同的基因，編碼6種已知的蛋白質： RTCD1、 MOCS2、A2M、

7、KCNIP1、BTBD2和TOX2，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫及相關文獻獲得了它們的功能信息。其中 A2M與糖尿病血管病變密切相關，也進一步提示 FAM172A參與了糖尿病大血管病變的發(fā)病。,（1）用體內(nèi)實驗來研究蛋白質的相互作用，方法精確，不受外界影響，易于操作; （2）所有操作均在核酸水平進行，無需純化大量的蛋白質，可以精確測定蛋白質的弱相互作用； （3）運用范圍較大：酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白可以是完整的蛋白質，也可以是蛋白質的一個功能區(qū)，可以大到一個完整的腫瘤抑制蛋白，也可以小到一個約22個氨基酸的多肽。,酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點,局限性,1、它并非對所有蛋白質都適用。 有其原理決定，融合蛋

8、白的相互作用激活報告基因轉錄是在細胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達的融合蛋白在細胞內(nèi)能否正確折疊并運至核內(nèi)是檢測的前提條件。 2、假陽性較多： 某些誘餌蛋白具有自身激活性質。 如AD融合靶蛋白有DNA的特異 結合，則可單獨激活報告基因的表達。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。,局限性,3、陰性干擾：兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。 蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。 某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達或不能準確定位到胞核內(nèi)。 4、融合蛋白的表達對細胞有毒性，應選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。,在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)展

9、出了酵母單雜交、酵母三雜交技術。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究。,酵母單雜交,酵母單雜交體系是借鑒酵母雙雜交體系的基本原理，通過觀察酵母細胞內(nèi)報告基因的表達狀況，研究DNA與蛋白質之間的相互作用。,酵母單雜交步驟,設計含目的基因（誘餌）和下游報告基因的質粒，將其轉入酵母細胞中。 將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒轉化入同一酵母細胞中。 若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達將其篩選。,單雜交優(yōu)點,實驗過程簡單，耗時短：能直接識別并找出與特異順式作用元件相結合的蛋白質及其編碼序列，而不需通過制備純化蛋白或抗體等繁

10、瑣的生化手段來建立這種相互作用關系； 酵母屬于真核生物，且蛋白質處于自然構象，避免了體外研究的不足。,單雜交局限性,與內(nèi)源性的表達激活因子發(fā)生相互作用； 假陽性：插入的靶元件有可能不需要轉錄激活因子就可以直接激活報道基因的表達； 假陰性：融合蛋白有毒性、不能穩(wěn)定地表達，錯誤折疊不能準確定位于酵母細胞核內(nèi)、DNA 結合位點被封閉； 酵母細胞內(nèi)蛋白修飾缺乏；,TF: 介導蛋白質相互作用的第三種因子， 可以是蛋白質,DNA,RNA或小分子配體。,兩個蛋白之間通過第三者發(fā)生相互作用，用來檢測蛋白質與RNA、蛋白、小分子配體間相互作用,酵母三雜交技術,應用,1、研究RNA-蛋白質間相互作用,應用,2、研究小分子受體與蛋白質受體間相互作用,在該系統(tǒng)中, 第三個雜交小分子為Dex(地塞米松)-FK506 偶聯(lián)體, 利用已知的地賽米松受體和FK506 受體FKBP12 分別構建AD 和BD 融合蛋白, 三種分子相互作用后, 成功的激活了報道基因的表達;而當單體FK506 分子引入時, 由于競爭性結合FKBP12 , 導致三元復合物無法形成, 幾乎完全抑制了報道基因的表達。,舉例,3、研究復雜的蛋白-蛋白間相互作用,應用,不能用來研究位于細胞核外的RNA分子； 許