NO與神經(jīng)損傷

一、一氧化氮（nitric oxide, NO）的發(fā)現(xiàn),美國紐約州立大學(xué)藥理系Furchgott教授等（1953）采用兔胸主動(dòng)脈螺旋條標(biāo)本研究血管平滑肌上藥物、受體間的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論是否用去甲腎上腺素預(yù)先收縮，血管擴(kuò)張劑卡巴膽堿或乙酰膽堿（CCh or Ach）不僅未能使血管舒張、反而予盾地引起收縮。當(dāng)時(shí)曾錯(cuò)誤假設(shè)：血管平滑肌上可能存在興奮和抑制兩套膽堿能受體Furchgott等（1978）用兔主動(dòng)脈離體標(biāo)本（包括主動(dòng)脈環(huán)和螺旋條）研究腎上腺素受體亞型時(shí)，在一次加藥和沖洗錯(cuò)誤中，第一次發(fā)現(xiàn)對擬膽堿藥產(chǎn)生松馳反應(yīng)，而按標(biāo)準(zhǔn)方法制備的螺旋條，內(nèi)皮已被刮掉，對Ach產(chǎn)生收縮反應(yīng)，提示Ach的血管舒張反應(yīng)依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的存在,Furchgott等（1979）采用所謂“三明治夾心標(biāo)本”證實(shí)Ach作用于血管內(nèi)皮，產(chǎn)生一種非前列腺素類的彌散因子，后者作用鄰近平滑肌細(xì)胞而產(chǎn)生舒張反應(yīng)Furchgott和Zawadski （1980）將題為“The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine”的論文投送英國Nature雜志，幾經(jīng)周折，被減縮成來信形式發(fā)表Furchgott （1982）在一篇論文中首次將這種內(nèi)皮細(xì)胞介質(zhì)稱為內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子（endothelium-derived relaxing factor, EDRF）美英兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室（1987）同時(shí)證明這種EDRF就是NOFurchgott 、Ignarro and Marud（1998）被授予諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),二、一氧化氮的研究已成為熱點(diǎn),1994和1995年，MEDLINE收錄的有關(guān)NO研究論文達(dá)2500篇/年有關(guān)NO研究的一些重要結(jié)果或發(fā)現(xiàn)，多數(shù)發(fā)表在Nature、Proc Natl Acad Sci USA、J Biol Chem、Neuroscience、Br J Pharmacol、Am J Physiol等一些國際著名期刊上世界普名大學(xué)如耶魯大學(xué)、約翰霍普金斯大學(xué)、杜克大學(xué)、康乃爾大學(xué)、劍橋大學(xué)等均有規(guī)模不小的NO研究隊(duì)伍NO成為熱點(diǎn)主要有兩方面的原因：NO作用的廣泛性，參與體內(nèi)眾多的病理生理過程，并已有臨床應(yīng)用，而且可能有新的臨床應(yīng)用前景，這使生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域和制藥公司的專家也加入到開發(fā)研制NO藥物的行列；NO是迄今在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)氣體性信息分子，對今后其他信使的發(fā)現(xiàn)有重大啟發(fā),三、一氧化氮的化學(xué)特性,一種含不成對電子的氣體分子、分子很小、結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)活潑、易氧化在生物組織中半衰期僅有幾秒與Fe2+有很高的親和力具有脂溶性，極易透過細(xì)胞膜快速擴(kuò)散NO與O2-以極快的反應(yīng)速率反應(yīng)生成氧化活性更強(qiáng)的ONOO-,四、神經(jīng)系統(tǒng)中一氧化氮的合成,1. 一氧化氮合酶,一氧化氮通過一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）催化氧化L-精氨酶而生成三種同功酶：存在于內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）；存在于神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）；存在于巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）。eNOS和nNOS均為構(gòu)成型酶，統(tǒng)稱為構(gòu)成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase, cNOS）,三種NOS由不同基因編碼：eNOS基因定位于7號染色體，長度約為21kb，有26個(gè)外顯子；nNOS基因定位于12號染色體，長度為150kb，有29個(gè)外顯子；iNOS基因定位于17號染色體，長度為37kb，有26個(gè)外顯子（Mayer and Hemmens, 1997）每種同功酶具有相同催化中心結(jié)構(gòu)：羧基端為還原酶區(qū)，包括FAD（flavin adenine dinucleotide）、FMN（flavin mononucleotide）、NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）的結(jié)合位點(diǎn)；氨基端為氧化酶區(qū)，包括一個(gè)血紅素輔基和一個(gè)四氫生物蝶呤（terahydrobiopterin, BH4）的結(jié)合位點(diǎn)NOS還原酶區(qū)域還有一個(gè)鈣調(diào)蛋白（calmodulin, CaM）結(jié)合位點(diǎn)，NOS只有與CaM結(jié)合才具催化活性，cNOS的活性受鈣離子調(diào)控；iNOS由于CaM與酶結(jié)合緊密，其活性基本不受鈣離子影響,2. 神經(jīng)系統(tǒng)中一氧化氮的合成及其調(diào)控,在突觸后神經(jīng)元，谷氨酸等興奮氨基酸結(jié)合到NMDA受體（N-methyl-D-aspartate receptor）上，引發(fā)Ca2+內(nèi)流，Ca2+結(jié)合CaM后激活nNOS，從而產(chǎn)生NO其它與離子通道偶聯(lián)的谷氨酸受體亞型如AMPA受體（-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor）、紅藻氨酸受體（Kainate receptor）可能參與了神經(jīng)元中NO合成的過程乙酰膽堿、腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)也具有調(diào)控作用（Garthwaite and Boulton, 1995）PKA、PKC、PKG、CaM-K等蛋白激酶都能通過磷酸化修飾nNOS而調(diào)控酶的活力（Zhang and Snyder, 1995）,NO通過促進(jìn)cAMP和cGMP的產(chǎn)生而對nNOS的活性也具有調(diào)控作用海馬神經(jīng)元中NO的合成還受神經(jīng)生長因子等細(xì)胞因子的調(diào)控（Lam et al, 1998）膠質(zhì)細(xì)胞中NO主要通過不依賴于Ca2+信號的iNOS合成內(nèi)毒素，以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）、白介素-2（interleukin-2, IL-2）、-干擾素（interferon-r，IFN-）等細(xì)胞因子誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)iNOS，從而使膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)地產(chǎn)生NO（Gross and Wolin, 1995）,五、一氧化氮在神經(jīng)系統(tǒng)中的生理作用,1. 一氧化氮的主要作用“靶”,主要分兩大類：一類是蛋白質(zhì)的血紅素輔基、鐵硫中心如可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase, sGC）、烏頭酸酶；另一類是與蛋白質(zhì)生理功能密切相關(guān)的某些“活性”疏基如血紅蛋白的Cys 93半胱氨酸殘基、NMDA受體的氧化還原調(diào)控位點(diǎn)sGC是一種含有血紅素輔基的酶，以三磷酸鳥苷為底物合成環(huán)單磷酸鳥苷（cGMP），NO與sGC中血紅素輔基的鐵離子結(jié)合，使sGC構(gòu)象發(fā)生改變，激活sGC，大大增加cGMP的產(chǎn)生。cGMP作用于血管平滑肌，使平滑肌舒張，增加血流、降低血壓。cGMP通過調(diào)控多種離子通道、蛋白激酶、磷酸二酯酶而啟動(dòng)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，執(zhí)行包括調(diào)節(jié)腦血流、學(xué)習(xí)、記憶、調(diào)控基因表達(dá)等在內(nèi)的多種重要生理功能（Gathwaite and Boulton, 1995; Belsham, et al, 1996）,2. 一氧化氮對神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控作用,NO常與其它神經(jīng)遞質(zhì)共同發(fā)揮生理作用如小腦顆粒細(xì)胞具有谷氨酸受體，藍(lán)狀細(xì)胞是一種-氨基丁酸（-amino-n-butyric acid; GABA）能神經(jīng)元，而紋狀體一氧化氮合酶陽性神經(jīng)元以神經(jīng)肽Y作為神經(jīng)遞質(zhì)在腦片、培養(yǎng)細(xì)胞、突觸體等不同實(shí)驗(yàn)體系中，內(nèi)源或外源NO對多巴胺（zhu and Luo, 1992）、乙酰膽堿（Hirsch et al, 1993）、去甲腎上腺素（Montagne et al, 1994）、GABA（Ohkuma et al, 1996）、谷氨酸（Bonfoco et al, 1996）等多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放均有調(diào)控作用,3. 一氧化氮對受體的調(diào)節(jié)作用,Liptun等系統(tǒng)研究NO對NMDA受體的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)NMDA受體具有氧化還原調(diào)控位點(diǎn)、NO以及由其衍生的亞硝酰離子等化合物通過與該位點(diǎn)的疏基結(jié)合而部分改變NMDA受體的構(gòu)象、從而抑制由NMDA受體激活引起的鈣離子內(nèi)流、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞（Lipton et al, 1996, 1998）,六、一氧化氮與神經(jīng)損傷,一氧化氮引起細(xì)胞損傷的機(jī)制,1. 一氧化氮對線粒體的損傷作用。N0引起的線粒體功能障礙可能是早老性癡呆，帕金森氏病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要病原因素之一（Heales et al, 1999）Bolanos等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性 及外 源性NO均不可逆地抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體II-III、復(fù)合體IV的活力（Bloanos et al, 1994,1996,1997）Stamler推測NO可能通過破壞鐵硫中心而導(dǎo)致呼吸鏈酶失活（Stamler, 1994）Clementi等推測NO可能通過氧化修飾呼吸鏈酶的疏基而表現(xiàn)出抑制作用（Clementi et al, 1998）,線粒體呼吸的抑制直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，引起細(xì)胞凋亡（Richter et al, 1996）線粒體呼吸鏈酶被抑制后，線粒體電子泄漏增加，導(dǎo)致內(nèi)源性超氧陰離子（O2-）的產(chǎn)生，而O2-與NO反應(yīng)生成的ONOO-進(jìn)一步對線粒體造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡（Podertosd et al, 1996;Bolanos et al, 1995; Wei et al, 1998）,NO直接導(dǎo)致DNA鏈交聯(lián)、斷裂，引起細(xì)胞受損（Nguyen et al,1992）神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)高濃度的谷氨酸處理后，由谷氨酸受體激活產(chǎn)生的內(nèi)源性NO導(dǎo)致DNA鏈斷裂，并激活聚腺苷二磷酸核糖基合成酶（Zhang et al,1994）活化后的聚腺苷二磷酸核糖基合成酶以NAD+為底物，對受體蛋白進(jìn)行修飾，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NAD+耗竭（de Murcia et al,1994）合成Imol NAD+需要消耗4mol ATP，因此NAD+耗竭又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭，引致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，甚至細(xì)胞死亡,2. NO對DNA的損傷作用,3. NO對機(jī)體抗氧化體系的損傷作用,NO及其相關(guān)化合物（亞硝酸離子、過氧化亞硝基等）不僅直接氧化維生素C、E、尿酸、小分子疏基化合物等內(nèi)源抗氧化劑，破壞非酶抗氧化防御體系，還對過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活力有抑制作用，這些抗氧化酶的失活導(dǎo)致胞漿內(nèi)過氧化物含量升高，引發(fā)細(xì)胞氧化損傷（Gross and Wolin,1995;Padmaja et al,1998; Asahi et al,1995）,1. 一氧化氮與腦缺血損傷,NO在腦缺血過程中起著典型的“雙刃劍”作用，既能部分緩解腦缺血，又介導(dǎo)更嚴(yán)重的損傷腦缺血初期，由eNOS產(chǎn)生的NO能夠擴(kuò)張血管，抑制血小板、白細(xì)胞的粘附，從而部分緩解缺血，同時(shí)NO通過修飾NMDA受體的氧化還原調(diào)控位點(diǎn)而減弱由谷氨酸釋放而引起的鈣離子內(nèi)流，部分減輕腦損傷（Iadecola,1997）隨著缺血時(shí)間延長，nNOS產(chǎn)生大量NO，同時(shí)nNOS的底物（L-精氨酸）以及輔因子（BH4）等逐漸成為NO合成的限制因素，導(dǎo)致O2-，H2O2等活性氧生成（Mayer and Hemmens,1997）腦缺血后期，由中性粒細(xì)胞、星形細(xì)胞iNOS持續(xù)產(chǎn)生的大量NO，也參與了缺血引起的神經(jīng)元死亡,七、一氧化氮與神經(jīng)系統(tǒng)疾病,2. 一氧化氮與早老性癡呆,早老性癡呆（Alzheimers disease, AD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，占65歲以上老年人的5-10%（Hurtley, 1998）主要表現(xiàn)為記憶力減退、智力低下病理改變主要包括廣泛的神經(jīng)元減少（在大腦皮層和海馬中表現(xiàn)得尤為明顯）、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（ neurofibrilloy, tangles）、細(xì)胞外形成老年斑（senile plaque）在AD患者腦組織中常有幾種異常蛋白的表達(dá)水平增高，其中研究較多的有-淀粉樣蛋白（amyloid -peptide, AB，一種含有39-43個(gè)氨基酸殘基的疏水性蛋白，是老年斑的主要成分之一）、S100蛋白（星形細(xì)胞產(chǎn)生的一種鈣離子結(jié)合蛋白）等研究顯示，A能夠激活神經(jīng)元、星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO和O2-、H2O2（Akama et al, 1998; Hu et al, 1998; Mark et al, 1997; Suo et al,1997）。S100能夠激活星形細(xì)胞產(chǎn)生NO（Hu and Van Eidik,1996）。同時(shí)產(chǎn)生的NO、O2-對細(xì)胞具有協(xié)同損傷作用,3. 一氧化氮與帕金森氏病,帕金森氏?。≒arkinsons disease, PD）也是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以運(yùn)動(dòng)障礙、肌強(qiáng)直、靜止性震顫為典型特征病理特征是腦區(qū)內(nèi)黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元大量死亡最常用的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型是采用MPTP引起多巴胺能神經(jīng)元選擇性死亡研究表明MPTP處理導(dǎo)致酪氨酸羥化酶硝基化，使酪氨酸羥化酶失活，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)多巴胺水平下降、多巴胺能神經(jīng)元死亡（Ara et al, 1998）PD患者多巴胺能神經(jīng)元周圍存在大量表達(dá)iNOS的膠質(zhì)細(xì)胞，由膠質(zhì)細(xì)胞iNOS產(chǎn)生的高濃度NO可能是多巴胺能神經(jīng)元死亡的重要原因之一（Hirsch et al, 1998）,4. 一氧化氮與多發(fā)性硬化癥,多發(fā)性硬化癥（mutiple sclerosis, MS）是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的自身免疫疾病，目前的研究表明，NO以及由N