博士研究生課高級(jí)生物化學(xué)與分子生物學(xué)專題分子生物學(xué)技術(shù)在病理學(xué)上的應(yīng)用許麗艷.

1、Application of Molecular Biology Technique in the Pathology DNA Analysis Southern Blot: telomere length; amplification; deletion PCR: mutation; virus In situ hybridization: gene location; translocation DNA Chip: SNP Bioinformatics RNA Analysis Northern Blot : expressed genes RT-PCR: expressed genes

2、In situ hybridization: gene location cDNA microarray : differentially expressed genes Bioinformatics Protein Analysis Western Blot: protein concentration Immunohistochemical Technique: protein location 2-D Electrophoresis: differerentially expressed proteins Bioinformatics 雙向電泳技術(shù)及其應(yīng)用 雙向電泳技術(shù)的原理 利用蛋白質(zhì)

3、等電點(diǎn)和分子量的不同來(lái) 分離復(fù)雜蛋白質(zhì)組分 雙向電泳技術(shù)的發(fā)展歷史 1975年O， Farrell首先提出了經(jīng)典的雙向電 泳技術(shù)體系。他用管狀載體兩性電解質(zhì)凝膠作為 第一向進(jìn)行等電聚焦，聚焦聚焦后的管狀凝膠在含 SDS的緩沖液中平衡后，以瓊脂糖包埋置于垂直 板SDS凝膠的濃縮膠上，然后用Laemmli的不連 續(xù)SDS梯度凝膠電泳作為第二向。這種雙向電泳 技術(shù)被稱之為ISO-DALT系統(tǒng)。ISO-DALT系統(tǒng)存 在著許多問(wèn)題，如易發(fā)生陰極漂移，載體兩性電 解質(zhì)pH梯度不穩(wěn)定以及重復(fù)性差等。 1985年年G rg A等發(fā)展了等發(fā)展了IPG-DALT系統(tǒng)雙系統(tǒng)雙 向電泳技術(shù)。它利用固相向電泳技術(shù)。它

4、利用固相pH介質(zhì)來(lái)形成一定范介質(zhì)來(lái)形成一定范 圍的圍的pH梯度。固相梯度。固相pH介質(zhì)是一類丙烯酰胺的介質(zhì)是一類丙烯酰胺的 化合物，它與聚丙烯酰胺共價(jià)結(jié)合后形成一定化合物，它與聚丙烯酰胺共價(jià)結(jié)合后形成一定 范圍的范圍的pH梯度。它不受脫水、重新水化和電場(chǎng)梯度。它不受脫水、重新水化和電場(chǎng) 等因素的影響，因而具有不產(chǎn)生陰極漂移，等因素的影響，因而具有不產(chǎn)生陰極漂移，pH 梯度穩(wěn)定，上樣量大，重復(fù)性好，分辨率高等梯度穩(wěn)定，上樣量大，重復(fù)性好，分辨率高等 優(yōu)點(diǎn)。目前世界上越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室選擇優(yōu)點(diǎn)。目前世界上越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室選擇IPG- DALT系統(tǒng)雙向電泳技術(shù)。系統(tǒng)雙向電泳技術(shù)。 樣品的預(yù)處理 樣品的

5、預(yù)處理是雙向電泳的重要環(huán)節(jié)之一。 雙向電泳樣品預(yù)處理的目的之一就是使樣品在 樣品緩沖液中充分溶解、變性和還原，完全打 破蛋白之間的相互作用。通常的樣品緩沖液包 括8M尿素，4%(w/v)CHAPS，50-100mM DTT和 40mM Tris。然而這種“標(biāo)準(zhǔn)”的樣品緩沖液 并非對(duì)所有蛋白質(zhì)的預(yù)處理都是理想的，特別 是膜蛋白、與膜相連的蛋白質(zhì)以及具有高抗性 組織的蛋白(如頭發(fā)和皮膚等)。 最近有許多可改變這些蛋白質(zhì)溶解度的報(bào)道。如 Rabilloud等介紹了用硫脲(2M)和尿素(5-7M)來(lái)增加 蛋白的溶解。Herbert等用不帶電荷的三丁基膦 (tributyl phosphine，TBP)

6、代替含巰基的還原劑DTT， 它既可增加蛋白的溶解，同時(shí)又不會(huì)因DTT在堿性環(huán) 境帶電而造成蛋白的丟失，特別是對(duì)于那些易于以二 硫鍵相互作用的蛋白質(zhì)(如角蛋白)。另外，樣品的預(yù) 處理還應(yīng)考慮去除非蛋白質(zhì)組分(如核酸、鹽離子)。 在細(xì)胞蛋白質(zhì)變性之前應(yīng)通過(guò)透析（或?qū)游觯┖臀⒘?的 DNase/RNase來(lái)去除鹽離子和核酸，以減少條紋和 不均一背景的出現(xiàn)。 膠條的選擇和第一向等電聚焦 目前商品化的IPG膠條已逐漸為各實(shí)驗(yàn)室所采用。膠條的 選擇直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。通常選膠的原則主要 有以下幾點(diǎn)：1.快速篩選或僅對(duì)最高豐度蛋白質(zhì)感興趣時(shí) 可選擇短膠條，而要獲得最高分辨率和最大上樣量時(shí)可 選擇長(zhǎng)膠條

7、。2.選擇pH為3-10的膠條可觀察細(xì)胞總蛋白 的分布，并可分離盡可能多的蛋白質(zhì)。而使用窄pH范圍 (如pH6-7)能更精確研究這一感興趣pH范圍的蛋白質(zhì)。3. 對(duì)于一個(gè)未知樣品，可先使用較寬pH范圍的膠條來(lái)找出 所需蛋白質(zhì)的位置，然后再用合適的窄pH范圍的膠條更 好地分辨這些蛋白點(diǎn)。 IPG膠條經(jīng)再水化和加樣后可進(jìn)行第一向等電聚焦。 通常的聚焦參數(shù)包括時(shí)間、溫度和電壓。合適的聚焦時(shí) 間取決于樣品量、膠長(zhǎng)和pH范圍等。聚焦的溫度最好在 20左右。因?yàn)闇囟冗^(guò)低(4以下)，尿素會(huì)結(jié)晶失去其 原有的作用；而溫度過(guò)高則會(huì)造成尿素結(jié)構(gòu)的破壞，產(chǎn) 生異硫氰酸鹽而使蛋白發(fā)生氨基甲?；?，最終導(dǎo)致蛋白 質(zhì)等電點(diǎn)

8、的改變。在等電聚焦過(guò)程中通常先設(shè)置低電壓 促使樣品進(jìn)入凝膠和去除過(guò)量的鹽離子，然后再用高電 壓進(jìn)行等電聚焦。若采用專門(mén)的雙向電泳裝置和附件進(jìn) 行等電聚焦，可先按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和設(shè)置各參數(shù)，再 經(jīng)過(guò)不斷的摸索得出最佳的聚焦條件。 平衡 平衡的目的是使蛋白質(zhì)分子與SDS充分的相互作用，使蛋白 質(zhì)根據(jù)分子量的大小而進(jìn)行第二向遷移。一般的步驟是先在第一 步平衡緩沖液（含DTT和SDS）中平衡1015min，再在第二步平 衡緩沖液（含碘乙酰胺和SDS）中平衡1015min。平衡的時(shí)間不 宜過(guò)長(zhǎng)。因?yàn)榈谝幌虻入娋劢故褂玫氖欠窍拗菩阅z，孔徑較大， 平衡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蛋白分子的擴(kuò)散，使結(jié)果出現(xiàn)橫紋。Yan等

9、 發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變平衡緩沖液pH值(pH8.0)，烷基化試劑的濃度 （125mM碘乙酰胺）和平衡時(shí)間（15min）可將幾乎所有的Cys 烷基化，這個(gè)修改不但不改變雙向電泳蛋白質(zhì)組模式，而且更利 于在基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOFMS) 分析時(shí)進(jìn)行蛋白消化。 IPG膠條的轉(zhuǎn)移 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 染色 銀染 考馬斯亮藍(lán)染色 熒光標(biāo)記 放射自顯影 凝膠圖像分析及數(shù)據(jù)處理 SDS凝膠經(jīng)染色后，可用圖像掃描儀或數(shù)碼 照相系統(tǒng)等把復(fù)雜的蛋白質(zhì)圖譜用數(shù)字化格 式捕獲并為下一步分析提供依據(jù)。利用凝膠 圖像分析軟件進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消除和匹 配分析以找出差異表達(dá)的蛋白，通過(guò)質(zhì)譜及 N端測(cè)

10、序等鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。常用的分析 軟件有PDQuest、ImageMaster 2-D、 Melanie和Phoretix 2D等 基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 （MALDI-TOF-MS） 肽質(zhì)量指紋圖 Auto MS-Fit軟件進(jìn)行搜索 (/ucsfhtml4.0u/msfit.htm)。 電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS） 生物信息學(xué)分析 1 2 3 4 5 6 SDS-PAGE 310 圖1 SHEE細(xì)胞(左)與SHEEC細(xì)胞（右）可溶性 總蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜差異表達(dá)分析 圖2 1號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜 Spot No

11、. Accession No. Theoretic Mr theoretic Mr Intensity Matched (%) Length (AA) expressionProtein name 110719660555494.810%494RNPEP-like protein 21916615759408.844%654ribosomal RNA gene upstream sequence binding transcription factor 335053354938.227%331uracil DNA glycosylase 416306978386187.647%339annex

12、in A2 57428977929289.244%832p300/CBP- associated factor 6 new protein 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) protein RNA DNA 生物芯片技術(shù)及其應(yīng)用 生物芯片的概念及其原理 概 念：主要指通過(guò)平面微細(xì)加工技術(shù)在固 體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)， 以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其它生物 組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。生物 芯片是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有 深遠(yuǎn)意義的科學(xué)革命。 原理： 堿基互補(bǔ)雜交 抗原抗體反應(yīng) 配體和受體相互作用 生物芯片的分類 DNA芯片 膜芯片 模式生物芯片 蛋白質(zhì)芯片 玻璃芯片 自行設(shè)計(jì)芯片

13、組織芯片 生物芯片技術(shù)的應(yīng)用（與醫(yī)學(xué)相關(guān)）： 研究疾病的發(fā)病機(jī)理 臨床疾病的診斷 生物基因多態(tài)性分析 篩選藥物 法醫(yī)學(xué)鑒定 Tissue(Cell) 1 Tissue (Cell) 2 Total RNA Total RNA PolyA+ +mRNAmRNA PolyA+ +mRNAmRNA Probe 1 Probe 2 Microarray membrane 1 Microarray membrane 2 Analysis Identification COORDINATE GENBANK LOCUS LINKSWISSPROTRatio(H5E31/92)GENE NAME A7cY00

14、5033880P087272.585992keratin 19 C6nX8785255558P518050.301826SEX gene C3eD212355886P547250.437793RAD23 (S. cerevisiae) homolog A D2jU439013921P088652.692179laminin receptor 1 (67kD, ribosomal protein SA) D5eU597529266Q157952.107921pleckstrin homology, Sec7 and coiled/coil domains 2 (cytohesin-2) D5gX

15、515217430P15311 P23714 2.928384villin 2 (ezrin) E2hM155185327P007504.065384plasminogen activator, tissue A1fX663651021Q005343.500128cyclin-dependent kinase 6 E3eX176204830P155315.216105non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in E3fL167854831P223922.34096non-metastatic cells 2, protein (NM2

16、3B) expressed in E4eM645955880P151532.448439ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 (rho family, small GTP binding protein Rac2) E6dM234103728P149232.003283junction plakoglobin http:/http:/http:/http:/ 新基因克隆及其功能研究策略 NNAAAAA _ 3 5 _ 3 _ NNTTTTT_ 5 Region to be amplified by 5-RACE Region to be ampl

17、ified by 3-RACE NGAL1 NGAL2 Generalized first-strand cDNA PolyA+ mRNA 圖1 5-RACE 和3-RACE反應(yīng)原理簡(jiǎn)圖 基因 表達(dá)調(diào)控 相互作用 生物信息學(xué) 生物學(xué)行為 生物信息學(xué)： http:/www.ncbi. nlm. 表達(dá)調(diào)控： 順式作用元件 酵母單雜交技術(shù) 相互作用： 免疫共沉淀 酵母雙雜交技術(shù) 生物學(xué)行為： 反義封閉 裸鼠實(shí)驗(yàn) 臨床樣本 基因敲除 Isolate DNAAmplify DNA, Label, & Hybridize to arrays + formaldehyde DNA Cell

18、lysis Sonicate 1kb DNA Target protein Y Add antibody *Add protein A beads Wash/Elute DNA-Protein complexes Y Y Reverse X-links Y DNA RNA Genotyping: Is it A or B? Gene Expression: Which genes? How much? Eukaryotic Cell One Genechip System DNA-Genotyping Family based linkage studies Whole-genome disease association Pharmacogenetics Chromosomal copy number Population genetics Linkage Disequilibrium Resequencing RNA-Expression Analysis Biomarker discovery Mechanism of Action Transcription factor binding Tra