利用厭氧型細(xì)菌治療腫瘤的研究

1、利用厭氧型細(xì)菌治療腫瘤的研究摘要隨著腫瘤抗藥性等問(wèn)題的不斷出現(xiàn)，厭氧菌對(duì)實(shí)體瘤的溶瘤作用引人關(guān)注。本文利用了厭氧型細(xì)菌在實(shí)體瘤治療中存在的優(yōu)勢(shì)及問(wèn)題，由于腫瘤的乏氧區(qū)不存在腫瘤特異性，因此以厭氧型細(xì)菌為載體的腫瘤分子靶向治療方案，可以有效克服傳統(tǒng)化學(xué)治療的不良反應(yīng)和抗體或小分子藥物分子靶向治療的缺陷，使實(shí)體瘤內(nèi)存在的乏氧區(qū)不再成為腫瘤治療的禁區(qū)。以及進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和以喂食、靜脈注射和直接注入實(shí)體瘤部位的方法來(lái)測(cè)定細(xì)菌的抗瘤效果以及未來(lái)的發(fā)展前景。關(guān)鍵詞厭氧菌；抗腫瘤；溶瘤作用；腫瘤治療一、 摘要隨著腫瘤抗藥性等問(wèn)題的不斷出現(xiàn)，厭氧菌對(duì)實(shí)體瘤的溶瘤作用引人關(guān)注。本文利用了厭氧型細(xì)菌在實(shí)體瘤治療中存

2、在的優(yōu)勢(shì)及問(wèn)題，由于腫瘤的乏氧區(qū)不存在腫瘤特異性，因此以厭氧型細(xì)菌為載體的腫瘤分子靶向治療方案，可以有效克服傳統(tǒng)化學(xué)治療的不良反應(yīng)和抗體或小分子藥物分子靶向治療的缺陷，使實(shí)體瘤內(nèi)存在的乏氧區(qū)不再成為腫瘤治療的禁區(qū)。以及進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和以喂食、靜脈注射和直接注入實(shí)體瘤部位的方法來(lái)測(cè)定細(xì)菌的抗瘤效果以及未來(lái)的發(fā)展前景。二、 立題依據(jù)腫瘤是一種基因病，但并非是遺傳的。它是指細(xì)胞在致瘤因素作用下，基因發(fā)生了改變，失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增生?？煞譃榱夹院蛺盒阅[瘤兩大類。前者生長(zhǎng)緩慢，與周圍組織界限清楚，不發(fā)生轉(zhuǎn)移，對(duì)人體健康危害不大。后者生長(zhǎng)迅速，可轉(zhuǎn)移到身體其它部位，還會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，破壞正常

3、器官結(jié)構(gòu)，使機(jī)體功能失調(diào)，威脅生命。早在150年前趨乏氧區(qū)定植和增殖且非致病性的厭氧菌就開(kāi)始被用于腫瘤治療1， 當(dāng)實(shí)體腫瘤存在的時(shí)候，腫瘤局部將出現(xiàn)一些與正常組織不同的微環(huán)境的改變，使細(xì)菌的繁殖成為可能2。其中腫瘤細(xì)胞的快速增殖性也給厭氧菌創(chuàng)造了微環(huán)境，使得用厭氧菌治療腫瘤成為了可能。在十九世紀(jì)初，Vaultier 就觀察到腫瘤患者發(fā)生細(xì)菌感染后腫瘤消退的現(xiàn)象。1868年，德國(guó)外科醫(yī)生W. Busch 開(kāi)始在小范圍內(nèi)嘗試用化膿性鏈球菌感染來(lái)治療腫瘤3。1976 年，Morales 等將卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG） 治療表淺膀胱腫瘤，此局面才有所扭轉(zhuǎn)。直到今

4、天，在許多國(guó)家BCG仍用于治療表淺膀胱腫瘤4。實(shí)踐已經(jīng)證明了利用厭氧型細(xì)菌治療腫瘤的可行性，將細(xì)菌用于腫瘤治療不是新觀點(diǎn)。三、 研究方案1 研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題本課題旨在探索厭氧型細(xì)菌在因快速增殖的腫瘤而造成的無(wú)氧環(huán)境下細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況以及腫瘤組織被細(xì)菌破壞的程度。腫瘤能逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)是發(fā)展腫瘤免疫治療的主要障礙, 使細(xì)菌侵入惡性瘤細(xì)胞，使細(xì)胞遞呈細(xì)菌抗原決定簇5。實(shí)體腫瘤的獨(dú)特病理生理特點(diǎn)使傳統(tǒng)抗腫瘤治療方法受到挑戰(zhàn)，同時(shí)也給厭氧菌提供了機(jī)會(huì)6。其原因在于腫瘤的生長(zhǎng)速度超過(guò)了其血管的生成速度，在實(shí)體瘤區(qū)形成的血管不足以提供整個(gè)瘤體所需的氧7。單獨(dú)使用厭氧菌僅能延緩腫瘤的生長(zhǎng)，

5、不能達(dá)到徹底根除，腫瘤會(huì)由周邊殘存的細(xì)胞復(fù)發(fā)8。為在將細(xì)菌注入機(jī)體時(shí)，細(xì)菌會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致注入的細(xì)菌失活，但對(duì)于初次細(xì)菌的患者，其治療效果相對(duì)于再次接觸同種細(xì)菌的效果好。因此，必須要細(xì)菌侵染腫瘤和細(xì)菌免受機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊之間尋找平衡點(diǎn)。利用腫瘤乏氧區(qū)域這一特征，具有廣闊的發(fā)展前景，目前已取得了初步的結(jié)果，但仍有諸多問(wèn)題需要解決9。其中，還有三大關(guān)鍵問(wèn)題10：其一，乏氧區(qū)遠(yuǎn)離血管難以獲得有效的藥物濃度；其二，治療必須特異地針對(duì)乏氧細(xì)胞，對(duì)不缺氧正常組織細(xì)胞無(wú)損害；最后，要攻擊的乏氧腫瘤細(xì)胞常常已停止分裂。但血供較為豐富的邊緣存活腫瘤細(xì)胞仍可造成腫瘤復(fù)發(fā)11。還有細(xì)菌感染后期，將細(xì)菌

6、從機(jī)體內(nèi)清除的關(guān)鍵性難題。2 采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析研究方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及基因工程技術(shù)技術(shù)路線：厭氧菌在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)為直接溶瘤效應(yīng)、治療基因載體及聯(lián)合溶菌療法等幾個(gè)方面。本課題旨主要是直接溶瘤效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)方案：如圖取一塊無(wú)限增殖的癌組織觀察腫瘤組織生長(zhǎng)狀況接種厭氧型細(xì)菌篩選出發(fā)生溶瘤部位的菌種分為三種方式注入小鼠體內(nèi)靜脈注射喂食直接注射腫瘤部位觀察溶瘤效果觀察溶瘤效果觀察溶瘤效果可行性分析：由于厭氧菌在腫瘤低氧壞死區(qū)內(nèi)選擇性定植生長(zhǎng)，使基因治療面臨的缺乏特異性基因治療載體的問(wèn)題有了新的希望，其對(duì)腫瘤的選擇性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于病毒載體。靜脈給菌后雙歧桿菌、沙門氏菌

7、、梭菌均被證明可優(yōu)先在實(shí)體瘤的厭氧區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，也不排除可能存在某些粘附分子使得厭氧菌具有腫瘤靶向性12。腫瘤逃避免疫是其難治愈的又一關(guān)鍵。許多厭氧菌能促進(jìn)機(jī)體對(duì)其靶向定植腫瘤的免疫識(shí)別和應(yīng)答13。專性或兼性厭氧菌能在腫瘤組織內(nèi)定植，可成為新的抗腫瘤治療方式14。腫瘤組織內(nèi)部特殊病理生理特點(diǎn)和厭氧菌自身的生物學(xué)特性是厭氧菌抗腫瘤應(yīng)用研究的基礎(chǔ)15：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)快，而瘤內(nèi)血管形態(tài)不規(guī)則、分支紊亂，實(shí)體腫瘤內(nèi)部形成乏氧微環(huán)境，有利于厭氧菌靶向定植于腫瘤組織；腫瘤組織代謝旺盛，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，可供厭氧菌利用，厭氧菌在瘤內(nèi)比正常組織具備更強(qiáng)的增殖能力，更易在腫瘤內(nèi)富集；腫瘤內(nèi)異常血管化和腫瘤組織間隙

8、的高壓使瘤內(nèi)免疫細(xì)胞、抗體、補(bǔ)體等數(shù)量減少且功能受到抑制，厭氧菌在瘤內(nèi)較難被免疫系統(tǒng)識(shí)別、清除；某些厭氧菌為益生菌或無(wú)致病性，致病性厭氧菌所致的繼發(fā)性感染可通過(guò)抗生素得到較好控制；厭氧菌基因容量較大，可進(jìn)行基因修飾，具備穩(wěn)定表達(dá)外源基因的能力，是良好的基因載體；厭氧菌的安全性較高，便于保存，無(wú)潛在的長(zhǎng)期副作用。理想?yún)捬蹙奶攸c(diǎn)有1, 16：對(duì)宿主無(wú)毒性；高度的腫瘤靶向性；廣泛的腫瘤實(shí)用性；具有繁殖能力并高效表達(dá)外源基因；可全身運(yùn)用；本身即具溶瘤作用；具有運(yùn)動(dòng)能力，可分布于整個(gè)乏氧壞死區(qū)；治療后可徹底清除(通過(guò)少量敏感抗生素或機(jī)體緩慢清除)。異常的血管化和腫瘤組織間隙的高壓阻止免疫成分隨血流進(jìn)人

9、腫瘤組織，形成免疫防御真空區(qū)為細(xì)菌提供了生存保護(hù)17。再就是腫瘤組織旺盛的代謝產(chǎn)生的大量中間產(chǎn)物也成為某些營(yíng)養(yǎng)缺陷型工程厭氧菌生存的有利條件18。不易被免疫監(jiān)視和免疫防御系統(tǒng)破壞，某些厭氧菌本身具有的抗瘤作用19等優(yōu)點(diǎn)。3 項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處項(xiàng)目的特色：利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及基因工程技術(shù)等多種技術(shù)結(jié)合，篩選出具有溶瘤較好的細(xì)菌，以及選出最適細(xì)菌濃度。創(chuàng)新之處：對(duì)于腫瘤的快速增殖而導(dǎo)致的缺氧環(huán)境有利于厭氧菌生長(zhǎng)。而厭氧菌具有競(jìng)爭(zhēng)和侵染腫瘤細(xì)胞的能力。4 年度研究計(jì)劃及預(yù)測(cè)進(jìn)展本課題擬在3年內(nèi)完成，各階段主要任務(wù)如下：2016年6月2017年6月，進(jìn)行第一期試驗(yàn)，掌握第一批基本數(shù)據(jù)，找出試驗(yàn)過(guò)程中

10、出現(xiàn)的問(wèn)題，并就大多數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步理論分析。 2017年6月2018年6月，對(duì)第一期試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行矯正，完善課題的每一個(gè)步驟，順利完成該年度試驗(yàn)（第二期試驗(yàn)），得出可靠的數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和理論分析。 2018年6月2019年6月，對(duì)前兩年所得結(jié)果中不合理的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證來(lái)矯正和更新，并就新發(fā)現(xiàn)的一些問(wèn)題進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。最終順利完成本課題。預(yù)測(cè)進(jìn)展:四、 研究基礎(chǔ)1 前期工作查閱了大量的綜述文獻(xiàn)。2 實(shí)驗(yàn)條件目前，依托開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備，合理的開(kāi)放制度能夠讓研究人員隨時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，提高研究工作的效率。所有試驗(yàn)條件基本能滿足課題的完成。3 學(xué)術(shù)與技術(shù)水平本組成員201

11、4年就讀遵義醫(yī)學(xué)院，本科學(xué)歷，目前為在校生。五、 經(jīng)費(fèi)預(yù)算支 出 科 目金 額 （萬(wàn)元）計(jì) 算 根 據(jù) 及 理 由比例科研業(yè)務(wù)費(fèi)實(shí)驗(yàn)菌種使用費(fèi)0.275%測(cè)試費(fèi)用0.2勞務(wù)費(fèi)0.2論文發(fā)表費(fèi)0.2其它業(yè)務(wù)0.2科技處管理費(fèi)用實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)0.3小型儀器設(shè)置費(fèi)用小型儀器購(gòu)買0.110%試劑購(gòu)買費(fèi)用0.30國(guó)內(nèi)外交流與協(xié)作0.410%其 它0.4作為資金儲(chǔ)備，以備不時(shí)之需5%合 計(jì) 4.0萬(wàn)元備注：參考文獻(xiàn) 1Jain R K, Forbes N S. Can engineered bacteria help control cancer?J. Proc Natl Acad Sci U S A, 20

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