槲皮素金屬配合物合成及清除自由基能力研究報(bào)告設(shè)計(jì)方案性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、槲皮素-金屬配合物的合成及清除自由基能力的研究 自由基是一類外層軌道含有未配對電子的原子團(tuán)或特殊狀態(tài)分子，其中與 人體關(guān)系最為密切的是氧自由基，如超氧自由基 (0-2 )、羥基自由基( 0H) 脂質(zhì)過氧化自由基(R00-)等，其中以O(shè)- 形成最早， OHR化性最強(qiáng)。通常自 由基在機(jī)體內(nèi)的生成和去除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷，但 是當(dāng)機(jī)體對自由基的清除能力減弱或自由基清除劑供給不足，以及攝入生成自 由基的物質(zhì)過多時(shí)，體內(nèi)的自由基相對過剩，會攻擊生物大分子如蛋白質(zhì)、核 酸、脂質(zhì)等，使其交聯(lián)或斷裂，進(jìn)而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致機(jī)體病變、 衰老和死亡。隨著氧自由基和抗氧化理論研究工作的

2、深入，特別是一些合成的 抗氧化劑在使用中存在一些毒性時(shí)，天然抗氧化劑的研究越來越受到人們的重 視。 1、刖言 黃酮類化合物(Flavo no ids)是目前倍受關(guān)注的天然活性產(chǎn)物之一。槲皮素 又名櫟精(quercetin)，是一種黃酮醇類天然化合物，來源于蘆丁的酸性水解產(chǎn) 物，化學(xué)命名為3,5,7,3,4- 五羥基黃酮(Que)，廣泛存在于大約 68%勺植物 中。分子式：C15H0O;分子量:302.23 ;結(jié)構(gòu)如下： 槲皮素廣泛分布于蔬菜、水果、干果、飲料及中草藥之中，槲皮素藥理作 用廣泛，具有降血壓、降血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗血小板聚集、抗炎、抗過敏、 抗氧自由基和抗心率失常等多種生物活性及

3、藥理作用。但由于槲皮素在水中溶 解度低,極大地影響了槲皮素在生物體內(nèi)的利用度。根據(jù)中藥配位化學(xué)原理，中 藥有機(jī)成分與微量元素結(jié)合后往往會提高其生物活性或產(chǎn)生新的生物活性。作 為金屬螯合劑，黃酮類化合物在金屬的生物可利用性方面起著重要的作用。將 黃酮類化合物與人體必需金屬元素形成配合物 , 并發(fā)揮其抗活性氧自由基的協(xié)同 增效作用是較為全新的研究領(lǐng)域 , 為槲皮素的開發(fā)利用開辟了新的途徑。本實(shí)驗(yàn) 將合成的三種配合物槲皮素銅（n）、槲皮素鐵（n）、槲皮素鋅（n）與配 43 體，在 Fenton 反應(yīng)機(jī)制產(chǎn)生羥自由基和光照核黃素產(chǎn)生過氧自由基的體系中進(jìn) 行了響應(yīng)行為的比較和探討。為槲皮素類新型藥物的尋

4、找和開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基 礎(chǔ)。 2、材料與方法 試劑：槲皮素（上?；瘜W(xué)試劑二廠，生化試劑）；鄰苯三酚；維生素C,食 品級；Tris-HCI緩沖溶液（pH=8.2）;醋酸鋅等試劑，除標(biāo)明外，其余試劑均 為分析純；全部實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。 儀器：磁力攪拌器、 pHS-3C 數(shù)字酸度計(jì)、 722型分光光度計(jì) 3、實(shí)驗(yàn)方法 3.1 配合物的合成 3.1.1 槲皮素-銅、鐵、鋅配合物的合成 按適宜的摩爾比 （槲皮素與醋酸銅為 2:1，槲皮素與醋酸鋅、氯化鐵均為 1:1） ，分別將金屬鹽溶液在攪拌下緩慢滴加到槲皮素溶液中。如：在不斷攪拌 下，按摩爾比為1:1將O.5mol/L的Zn（Ac）2乙醇溶液滴加到

5、O.5mol/L的槲皮 素乙醇溶液中，攪拌均勻。用5%NaOF乙醇溶液調(diào)節(jié) pH=9,水浴回流攪拌 70mi n,產(chǎn)生沉淀物，靜置冷卻后過濾，3000r/mi n離心分離，沉淀用無水乙醇 反復(fù)洗滌，以除去其中殘留的柚皮苷和游離的金屬離子，得到粗品。用丙酮與 冰醋酸以1: 1混合溶劑對粗品進(jìn)行重結(jié)晶，析出淺黃色針狀晶體，抽濾，45C 真空干燥。 3.2 抗氧化活性測定 3.2.1 槲皮素及槲皮素 -金屬配合物對羥自由基的清除作用測定 產(chǎn)生HO自由基的反應(yīng)體系是Fen ton反應(yīng): HO + Fe OH- + HO- + Fe 自由基一般存活時(shí)間比較短而且活性高，而水楊酸能有效捕捉HO自由基 且產(chǎn)

6、生有色產(chǎn)物。因此，若在該體系加入一定量的水楊酸，將發(fā)生如下反應(yīng)： 無色 +20H 產(chǎn)生的有色物質(zhì)在510nm處有強(qiáng)吸收。添加水楊酸后立即測定吸光度值 （此 值可作為Ao）。若在水楊酸捕捉自由基的體系中添加黃酮類物質(zhì)，由于黃酮類化 合物具有清除HO自由基活性，從而降低甚至完全清除 HO自由基，而使有色 物質(zhì)的濃度降低，在此條件下 44 測定吸光度值，則可用來測定黃酮類化合物對 HO自由基的清除效率。 在25mL比色管中依次加入2mmol/L FeSC4溶液 3mL 1mmol/L H2Q溶液 3mL搖勻，再加入 6mmol/L水楊酸3mL搖勻，加入蒸餾水補(bǔ)充至 25mL于 37 C水浴加熱15m

7、in后取出，測其吸光度 A。另取25mL比色管依次加入 2mmol/L FeSQ 溶液 3mL 1mmol/L H2Q 溶液 3mL，搖勻，分別加入1.0 x 10- 4mol/L 待測液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,于 37C水浴加熱 15min 后取 出，然后加入6mmol/L水楊酸溶液3mL繼續(xù)水浴加熱15min,取出用蒸餾水補(bǔ) 充至25mL，搖勻，測其吸光度 A。按下式計(jì)算清除率P。用維生素C作對照實(shí) 驗(yàn)。 清除率 P =（A-Ai）/A X 100% 3.2.2槲皮素及槲皮素-金屬配合物對超氧陰離子自由基（O2-）的清除實(shí)驗(yàn) 采用鄰苯三酚自氧化法測定橙皮苷鋅配

8、合物對超氧陰離子自由基（02 -）的 清除能力。 取pH為8.2的0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液4.5mL,置于25C水浴中 預(yù)熱 20min,分別加入 1mL 試樣(1.0 X 10-4, 2.0 X 10-4, 3.0 X 10-4, 4.0 X 10- 4, 5.0 X 10-4)和0.4mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 C水浴中反應(yīng) 5min,加入8mol/L HCl 1mL終止反應(yīng)，快速測定 325nm處的吸光度值 A，空白 對照組A以相同體積的蒸餾水代替樣品，按下式計(jì)算清除率P。用維生素C作 對照實(shí)驗(yàn)。 清除率(%)=(A0-Ai )/A 0X 100

9、% 4數(shù)據(jù)記錄與處理 4.1槲皮素及槲皮素-金屬配合物對羥自由基的清除作用測定 表1槲皮素對羥自由基的清除作用測定 1.0*10- 4mol/L 待測液 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Vc吸光度 0.4850 0.0420 0.0360 0.0310 0.0290 0.0250 清除率 0.0000 0.9134 0.9258 0.9361 0.9402 0.9485 圖1槲皮素對羥自由基的清除作用測定 45 vc青除率 0.9600- 率除清 0.9500- *系列1 0.9400. 0.9300-. 0.9200- 0.91001111 0510152025

10、Vc濃度(10A-6mol/L ) 0.9950 Fe清除率 0.9900 0.9850 0.9800 *系列1| 0.9600 0.9550 0.9500 0.9450 10 20 25 Fe配合物濃度（10八-6） 除 0.9700 清 0.9650 0.9750 表2槲皮素-鐵配合物對羥自由基的清除作用測定 1.0*10-4mol/L 待 測液 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Fe的吸光度 0.4850 0.0240 0.0180 0.0150 0.0100 0.0040 清除率 0.0000 0.9505 0.9629 0.9691 0.9794 0.991

11、8 圖2槲皮素-鐵配合物對羥自由基的清除作用測定 表3槲皮素-銅配合物對羥自由基的清除作用測定 46 1.0*10- 4mol/L 待測液 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Cu的吸光度 0.4850 0.2010 0.1820 0.1400 0.0950 0.0620 清除率 0.0000 0.5856 0.6247 0.7113 0.8041 0.8722 圖3槲皮素-鐵配合物對羥自由基的清除作用測定 0.9000 率除清 Ci配合物清除率 0.8500 0.8000 0.7500 0.7000 0.6500 0.6000 0.5500 0.5000 20 25

12、1015 Ci配合物濃度（10A-6mol/L *系列1 4.2槲皮素及槲皮素-金屬配合物對超氧陰離子自由基（O2-）的清除實(shí)驗(yàn) 表1槲皮素-金屬配合物對超氧陰離子自由基（O2 ）的清除測定 待測液濃度 mol/L 參比 （水） 1.0*10-4 2.0*10-4 3.0*10-4 4.0*10-4 5.0*10-4 Vc的吸光度 0.4970 0.0270 0.0210 0.0150 0.0040 0.0010 清除率 0.0000 0.9457 0.9577 0.9698 0.9920 0.9980 圖1槲皮素-金屬配合物對超氧陰離子自由基（02 ）的清除測定 47 Vc涓除率 L 010

13、0 1. 0000 0, 9900 毎 9800 B 9700 0. 9600 0. 9500 0.9100 0123 %濃度3T ) 表2槲皮素-鐵配合物對超氧陰離子自由基（O2- ）的清除測定 待測液濃度 mol/L 參比 （水） 1.0*10-4 2.0*10-4 3.0*10-4 4.0*10-4 5.0*10-4 Fe的吸光度 0.4970 0.4350 0.3210 0.2490 0.1810 0.1330 清除率 0.0000 0.1247 0.3541 0.4990 0.6358 0.7324 圖2槲皮素-鐵配合物對超氧陰離子自由基（Of ）的清除測定 Be配合物沾除率 0.8

14、000 0,7000 0.6000 5000 1000 3000 Q. 2000 0.1000 0.0000 0123456 Fe配合物濃度(10-lino 1 L) 表3槲皮素-銅配合物對超氧陰離子自由基（O2- ）的清除測定 48 待測液濃度 mol/L 參比 （水） 1.0*10-4 2.0*10-4 3.0*10-4 4.0*10-4 5.0*10-4 Cu的吸光度 0.4970 0.2030 0.1630 0.1290 0.1100 0.0750 清除率 0.0000 0.5915 0.6720 0.7404 0.7787 0.8491 圖3槲皮素-銅配合物對超氧陰離子自由基（0J

15、）的清除測定 0. 9000 0.8500 0.8000 0. 7500 7000- 摳 6500- 0.6000 0.5500- 0.5000 2345 Cu配合物濃度(10 - 1mol/L) 0 5結(jié)果分析討論 5.1槲皮素及槲皮素-金屬配合物對羥自由基的清除作用測定 槲皮素及其槲皮素一金屬配合物的基本結(jié)構(gòu)單元為黃酮醇，在骨架的3， 5, 7, 3，4位都有羥基和酚羥基，易被氧化，從而起到清除生物體內(nèi)氧自由 基的作用，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，槲皮素及其槲皮素一金屬配合物與02和OH的 反應(yīng)活性表現(xiàn)不同，表明槲皮素及其槲皮素一金屬配合物與0 和 OH反應(yīng)的 活性部位和作用機(jī)制可能不相同1。張英等2

16、對黃酮類化合物的研究證明，B 環(huán)鄰二酚羥基（3 ，4鄰二酚羥基），是清除OH勺關(guān)鍵功能團(tuán)，在抗氧化劑的 作用機(jī)制中，通過酚羥基與氧自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終 止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是最主要的。而在清除011 過程中，黃酮環(huán)共軛體系對未配對電子 的離域化可能在穩(wěn)定黃酮自由基中間起主導(dǎo)作用。C一2, 3位雙鍵，4 一OH是清 除0 的關(guān)鍵活性部位。3 以上結(jié)論可能對槲皮素及其金屬配合物也適用。當(dāng)槲皮素按物質(zhì)的量比為 2: 1接入銅、鐵離子后，環(huán)上的3位羥基與4位羰基與銅、鐵離子鍵合而改變了 其抗氧化活性，槲皮素強(qiáng)大的共軛環(huán)使其作為酸配體與鉬形成配合物后，整個(gè) 配合物又作為更強(qiáng)的路易氏酸來接受

17、02的耵電子，有效的電子離域化的結(jié)果 使槲皮素銅、鐵配合物與0 反應(yīng)的中間體可能更加穩(wěn)定；另一方面， 0H勺 活性主要表現(xiàn)在它的氧化性上，因此，3 , 4鄰二酚羥基和3-0H很敏感，從而 表現(xiàn)出槲皮素一銅、鐵配合物對 0H勺清除作用比槲皮素高。4 5.2槲皮素及槲皮素-金屬配合物對超氧陰離子自由基(02-)的清除實(shí)驗(yàn) 本研究結(jié)果顯示，槲皮素一銅配合物對 0= 有較強(qiáng)的清除能力，槲皮素一 鐵配合物 49 稍微遜色點(diǎn)，在一定濃度范圍內(nèi)，與其濃度成正比，并且明顯優(yōu)于槲皮素；槲 皮素和槲皮素一銅、鐵配合物都具有較好的清除0H的活性，在低濃度時(shí)，槲 皮素一銅、鐵配合物優(yōu)于槲皮素，在高濃度時(shí)槲皮素比槲皮素一金屬配合物的 抑制率高，因此，控制一定槲皮素一金屬配合物的濃度，使槲皮素一金屬配合 物發(fā)揮其較強(qiáng)的清除羥基自由基的作用，進(jìn)一步對槲皮素一金屬配合物的生物 活性進(jìn)行研究，為黃酮類藥物的研究提供一種新的思路和途徑 5 。 6 參考文獻(xiàn) 1 賈小燕 李文杰 柴保臣 朱明君 閻素清 槲皮素 - 鉬配合物的抗氧化作用 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版) 2008 年5月 第