動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體 2

1、2.2 動(dòng)物細(xì)胞工程選修3 現(xiàn)代生物科技專題 專題2 細(xì)胞工程教學(xué)目標(biāo)重點(diǎn)難點(diǎn)問題探討教學(xué)過程知識(shí)結(jié)構(gòu)教學(xué)反饋課后習(xí)題教學(xué)參考2.2.2 動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體教學(xué)目標(biāo)教學(xué)目標(biāo)n了解動(dòng)物細(xì)胞融合的原理、過程和意義。n理解單克隆抗體制備的過程和應(yīng)用重點(diǎn)難點(diǎn)重點(diǎn)難點(diǎn)n1.教學(xué)重點(diǎn)： 單克隆抗體的制備和應(yīng)用n2.教學(xué)難點(diǎn)： 單克隆抗體的制備過程 問題探討問題探討 “番茄馬鈴薯”（理想圖） 通過長期的實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家們通過長期的實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家們采用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得了采用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得了“番番茄茄馬鈴薯馬鈴薯”植株。植株。如果將奶牛的細(xì)胞與植物細(xì)胞雜交，得到綠色的小奶牛，那豈不是只要曬曬太陽就可以擠出

2、牛奶嗎？動(dòng)物細(xì)胞也能融合嗎？教學(xué)過程教學(xué)過程一一.動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合1.動(dòng)物融合的過程請同學(xué)們閱讀課本P52動(dòng)物融合滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性） 動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖不同DNA的兩個(gè)細(xì)胞 滅活的病毒有絲分裂兩個(gè)完整的雜交細(xì)胞滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理：n病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞

3、發(fā)生融合。n滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。思考題思考題1.1.植物體細(xì)胞雜交時(shí)首先應(yīng)用什么方法去掉細(xì)胞壁？植物體細(xì)胞雜交時(shí)首先應(yīng)用什么方法去掉細(xì)胞壁？ 酶解法，如纖維素酶或果膠酶酶解法，如纖維素酶或果膠酶2.2.動(dòng)物細(xì)胞融合時(shí)需要進(jìn)行去壁處理嗎？為什么？動(dòng)物細(xì)胞融合時(shí)需要進(jìn)行去壁處理嗎？為什么？無需，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁無需，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁3.3.植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？離心、電激等物理方法；離心、電激等物理方法；PEGPEG等化學(xué)方法等化學(xué)方法4.4.動(dòng)物細(xì)胞融合

4、能利用上述兩類方法嗎？還有其他方法嗎？動(dòng)物細(xì)胞融合能利用上述兩類方法嗎？還有其他方法嗎？能能 還可以利用滅活的病毒進(jìn)行誘導(dǎo)還可以利用滅活的病毒進(jìn)行誘導(dǎo)5.5.植物體細(xì)胞雜交應(yīng)先進(jìn)行原生質(zhì)體的融合再進(jìn)行組織培養(yǎng)形植物體細(xì)胞雜交應(yīng)先進(jìn)行原生質(zhì)體的融合再進(jìn)行組織培養(yǎng)形 成完整的雜種成完整的雜種個(gè)體，動(dòng)物細(xì)胞融合后能形成雜種動(dòng)物個(gè)體嗎？個(gè)體，動(dòng)物細(xì)胞融合后能形成雜種動(dòng)物個(gè)體嗎？不能不能7.7.你推測一下動(dòng)物細(xì)胞融合有哪些方面的應(yīng)用嗎？你推測一下動(dòng)物細(xì)胞融合有哪些方面的應(yīng)用嗎？思考題思考題 利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)誘導(dǎo)形成雜交瘤細(xì)胞利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)誘導(dǎo)形成雜交瘤細(xì)胞8.8.在生產(chǎn)實(shí)際中雜交瘤細(xì)胞有怎樣的

5、應(yīng)用？在生產(chǎn)實(shí)際中雜交瘤細(xì)胞有怎樣的應(yīng)用？ 生產(chǎn)單克隆抗體生產(chǎn)單克隆抗體6.6.你能歸納出什么叫做動(dòng)物細(xì)胞融合嗎？你能歸納出什么叫做動(dòng)物細(xì)胞融合嗎？9.9.意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動(dòng)植物之間）成為可能。科間、動(dòng)植物之間）成為可能。植物細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較植物細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合原理原理融合前處理融合前處理誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法主要用途主要用途細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞的全能性細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性 物

6、理方法物理方法（離心、振蕩、電激）離心、振蕩、電激） 化學(xué)方法（化學(xué)方法（PEG）物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)方法滅活的病毒滅活的病毒獲得雜種植株獲得雜種植株制備單克隆抗體制備單克隆抗體去除細(xì)胞壁后誘去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法從從血血清清中中分分離離抗抗體體多多種種效效應(yīng)應(yīng)B細(xì)細(xì)胞胞動(dòng)動(dòng)物物體體內(nèi)內(nèi)多多種種抗抗體體抗抗原原 提問？1.1.抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的？抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的？ 效應(yīng)效應(yīng)B B細(xì)胞（漿細(xì)胞）細(xì)胞（漿細(xì)胞）。2.2.一個(gè)淋巴細(xì)胞一個(gè)淋巴細(xì)胞( (漿細(xì)胞漿細(xì)胞) )能分泌多種抗體

7、嗎？能分泌多種抗體嗎？ 每一個(gè)淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。每一個(gè)淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。3.3.一種抗原侵入機(jī)體之后，引起機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一種抗原侵入機(jī)體之后，引起機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一種嗎？一種嗎？ 動(dòng)物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上。動(dòng)物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上。4. 4. 簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？ 抗原抗原 動(dòng)物體動(dòng)物體 抗體抗體 抗原不純抗原不純 抗體不純抗體不純單克隆抗體單克隆抗體刺激漿細(xì)胞6.6.如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？

8、體外培養(yǎng)單個(gè)淋巴細(xì)胞，提取分泌的抗體體外培養(yǎng)單個(gè)淋巴細(xì)胞，提取分泌的抗體7.7.體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞能無限增殖嗎體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞能無限增殖嗎? ?怎樣解決這個(gè)問題？怎樣解決這個(gè)問題？5.5.這種方法獲得的抗體有什么缺陷？這種方法獲得的抗體有什么缺陷？ 產(chǎn)量低，純度低，特異性差產(chǎn)量低，純度低，特異性差1.設(shè)計(jì)方案：一個(gè)一個(gè)B B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞能夠無限增殖小鼠骨髓瘤細(xì)胞能夠無限增殖二、單克隆抗體二、單克隆抗體2.制備過程：為什么給小鼠注射特定的為什么給小鼠注射特定的抗原蛋白？抗原蛋白？ 會(huì)有幾種融合方式？會(huì)有幾種融合方式？ 雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出

9、雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來的？有何特點(diǎn)？來的？有何特點(diǎn)？ 是否所有的雜交瘤細(xì)胞都是否所有的雜交瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生專一性抗體？能產(chǎn)生專一性抗體？ 如何大規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)得到如何大規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？大量的單克隆抗體？BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）（一選）（一選）用用特定的選擇特定的選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基篩選出多種雜交出多種雜交瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞獲得產(chǎn)生相應(yīng)獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的抗體的B B細(xì)胞細(xì)胞（二選）（二選）（克隆化（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞?？贵w的雜交瘤細(xì)胞。如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？如何進(jìn)行

10、雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞抗體的細(xì)胞，通常用，通常用“有限稀釋法有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液那些

11、上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔?？膳c特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行行有限稀釋，一般需進(jìn)行3 34 4次，直至確信每個(gè)孔中增次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)?；囵B(yǎng)。 在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個(gè)雜交瘤在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下，培養(yǎng)得到的細(xì)胞群是單個(gè)細(xì)胞的情況下，培養(yǎng)得到的細(xì)胞群是單個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體雜交瘤細(xì)

12、胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體必然是化學(xué)性質(zhì)單一的，特異性強(qiáng)的單克必然是化學(xué)性質(zhì)單一的，特異性強(qiáng)的單克隆抗體。這里的隆抗體。這里的單克隆單克隆確有確有單個(gè)細(xì)胞克隆單個(gè)細(xì)胞克隆的含義，只不過的含義，只不過克隆的克隆的不是不是B B淋巴細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞，而是雜交瘤細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞。 雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。專一抗體。免疫小鼠培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞注射特定抗原蛋白選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體檢驗(yàn)陽性專一抗體檢驗(yàn)陽性注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體單克隆抗體克隆雜交細(xì)胞分開不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗(yàn)陽性細(xì)胞 單克隆抗體制備過程示

13、意圖單克隆抗體制備過程示意圖多種雜交細(xì)胞（三）（三）單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用 與常規(guī)抗體相比，與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體特異性強(qiáng)，單克隆抗體特異性強(qiáng)，靈敏度高靈敏度高，并，并可大量制備可大量制備。應(yīng)用主要有：應(yīng)用主要有：1 1、作為診斷試劑、作為診斷試劑2 2、用于、用于治療疾病治療疾病和運(yùn)載藥物和運(yùn)載藥物準(zhǔn)確、高效、簡易、快速準(zhǔn)確、高效、簡易、快速 把抗癌細(xì)胞的單克隆抗體與藥物相結(jié)合，把抗癌細(xì)胞的單克隆抗體與藥物相結(jié)合，制成制成“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”。用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，靈敏度很高，在妊娠第8天就可以做出診斷，比原來的診斷方法提前了10天左右，可

14、以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90以上。知識(shí)結(jié)構(gòu)兩個(gè)過程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個(gè)“一”一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法 滅活的病毒一個(gè)新細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞一個(gè)優(yōu)勢單克隆抗體特異性 強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢教學(xué)反饋1.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最重要的用途是 （ ）A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和 B.制備單克隆抗體C.培育新物種 D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞B2.單克隆抗體是由下列哪種細(xì)胞產(chǎn)生的（ ）A.B淋巴細(xì)胞 B.T淋巴細(xì)胞 C.骨髓瘤細(xì)胞 D.雜交瘤細(xì)胞 D3.（多選）1975年米爾斯坦和柯勒成功地獲得了單克隆抗體。下列細(xì)胞中與單克隆抗體的制備有關(guān)的是（ ）A.效應(yīng)B細(xì)

15、胞 BT淋巴細(xì)胞C.骨髓瘤細(xì)胞 D雜交瘤細(xì)胞 A B C DB B體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 4.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實(shí)驗(yàn)方案制備單克隆抗體不能，沒有將抗原注入小鼠體內(nèi)，無法獲得產(chǎn)生單一抗體的B淋巴細(xì)胞。(1).該實(shí)驗(yàn)方案的目的是：_(2).該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？(3).A是從小鼠的脾臟中取得_ 該細(xì)胞能夠產(chǎn)生_ 。(4).圖中B為_過程，常用_作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承_的遺傳特性，既能_,又能_。(5).C過程指細(xì)胞培養(yǎng)，該過程包括_培養(yǎng)和_培養(yǎng)兩個(gè)階段，其中_代以內(nèi)

16、的的細(xì)胞屬于細(xì)胞株。B淋巴細(xì)胞抗體細(xì)胞融合滅活的病毒雙親細(xì)胞分泌抗體無限增殖原代傳代50課后習(xí)題課后習(xí)題1. 單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是 （ ）淋巴細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞A. B.C. D. C2.動(dòng)物細(xì)胞融合和植物原生質(zhì)融合決定于 ( )A.細(xì)胞膜的流動(dòng)性 B細(xì)胞膜的選擇透過性C.細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)性D細(xì)胞質(zhì)酶的活性 A一.選擇題3.“生物導(dǎo)彈”是指 （ ）A.單克隆抗體 B.雜交瘤細(xì)胞C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞 D.在單克隆抗體上連接抗癌藥

17、物 D4.只能使動(dòng)物細(xì)胞融合的常用誘導(dǎo)方法是 （ ）APEG B滅活的病毒 C電刺激 D離心A二.簡答題1.淋巴細(xì)胞是由動(dòng)物體-中的-細(xì)胞分化發(fā)育而來的。2.雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是-骨髓造血干主動(dòng)運(yùn)輸三.思考與探究1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？2.制備單克隆抗體時(shí)，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。接融合。 提示：哺

18、乳動(dòng)物感染抗原后，其體內(nèi)會(huì)形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞 能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動(dòng)物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會(huì)兼有兩個(gè)親本細(xì)胞的特性在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。 教學(xué)參考教學(xué)參考1.已成功的動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)例還有哪些？ 生物種類 細(xì)胞來源 成功年代 酵母菌雞 原生質(zhì)體血紅細(xì)胞 1975年人胡蘿卜 腹水癌細(xì)胞原生質(zhì)體 1976年人小鼠 纖維肉瘤細(xì)胞畸胎瘤細(xì)胞 1978年要知道更多的實(shí)例，需經(jīng)常查閱更多科研報(bào)道。2.為什么不用兩個(gè)而要用多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞間的融合？ 就目前常用的細(xì)胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個(gè)細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個(gè)細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的