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1、曹雙:請(qǐng)綜合看看各種方法,比較一下,有些內(nèi)容是一致的,有些是 每種方法不同于其他方法的,注意比較。第一篇(藍(lán)色部分為說(shuō)明和附錄,去掉這部分剩下的為連續(xù)文件)大腸桿菌檢驗(yàn)方法SN 0169 92出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方 法GB/T 4789.6 1994 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn) (這兩個(gè)檢驗(yàn)方法另有完全的 PDF文件,見文件夾)以SN標(biāo)準(zhǔn)方法為例,進(jìn)行說(shuō)明。樣品制備:以無(wú)菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000 r/min均質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。稀釋樣品勻液根據(jù)對(duì)樣品污染情況的
2、估計(jì),用稀釋劑將樣品勻液制成一系列 十倍遞增的樣品稀釋液,如10*-2、10*-3、10*- 4。從制備樣品勻液至稀 釋完畢,全過(guò)程不得超過(guò)15min。附:這是一種9管MPN法測(cè)定方法,什么是MPN法(最近似法)?MPN法簡(jiǎn)介發(fā)布日期:2010-05-13 瀏覽次數(shù):212The Most Probable Number MethodIn the followi ng example, a set of 3 tubes ofan all purpose broth medium is in ocuThe Most Probable Number MethodIn the follow ing
3、example, a set of 3 tubes of an all purpose brothmediumis inoculated from each of the ten-fold dilutions, with each tube being ino culated with one ml.從一ulb;"OO0 可爪I 1/7Illi- trHQJ ®0© a-JI 一 q -3- "Tvxie少 ®© I JAfter incubation.the number of tubes showing growth is rec
4、orded.Asthe succeed ing diluti ons were made, the orga ni sms were diluted to such an exte nt that none were in the ino cula of seve n of the tubes (marked n egative). I n order to estimate the nu mber of orga ni sms per ml of thesample which would cause this kind of growth response, we locate the t
5、hree sets of tubes which showdiluti on of the orga ni sms "to ext in cti on" i.e., those tubes which were inoculated from the 10- 2, 10 - 3 and 10 - 4 diluti ons.附錄1g檢樣中最近似值(MPN表(補(bǔ)充件)以 0.1、0.01、0.001g 各用 3 管陽(yáng)性管數(shù)丨1 MPN陽(yáng)性管數(shù) I1 MPN0.1 0.01 0.001| 0.1 0.01 0.001I 9.1| 14| 202601013|210| 150111
6、 6.1 |211| 2001219.2 |212| 27013I12 |213| 34020I 6.2 |220| 21021I 9.3 |221| 28022| 12 |222| 35023| 16 |223| 42030|9.4 |230| 29031|13|231| 36032| 16 |232| 440331|19|12331| 5310101|3.6 |3010| 23101|7.2 |301| 39102| 11 |302| 64103|15|303| 95110|7.3 |310| 43111| 11 |311| 75112|15|312| 120113|19|313| 160
7、120| 11 |320| 93121丨15|321 |1501221 20 |322 |210123124|323|290130I 16|330 |240131I 20|331 |460132I 24|332 |1100133I 29|333|> 1100LST和EC初步篩選:對(duì)每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三 管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±C 培養(yǎng)48±2h o觀察試管的產(chǎn)氣情況:檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生 ,用直徑為3mm的接 種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移
8、種于EC肉湯管中。將所有接 種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5 ±0.5 C水浴箱內(nèi),培養(yǎng)48±2h。附:LST肉湯、EC肉湯有些什么?LST肉湯和EC肉湯中有什么?(發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣)月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯EC肉湯胰蛋白(月示)或胰酪胨 仃rypticase) 20g胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g氯化鈉5.0g3號(hào)膽鹽或混合膽鹽1.5g乳糖5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75g磷酸氫二鉀(K2HPO4)4.0g磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.75g磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.5g月桂基硫酸氯化鈉5.0g鈉0.1g蒸餾蒸餾水
9、1000.0mL將以上成分溶解于蒸餾水中,分裝16mrW 150mm試管(管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵 將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的 20mrW 150mm試管中,每管10mL。121C高壓滅菌 15min。最終pH6.8±0.2。管),每管8mL。121C高壓滅菌15min,最終H6.9±0.1。EMB平板:取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板,36 ±1 C培養(yǎng)24±2 h。檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落 。如有典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落;如無(wú)典型菌落, 則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接
10、種針接觸菌落中心部位,移種到營(yíng) 養(yǎng)瓊脂斜面上,36 ±1 C培養(yǎng)1824h。附:怎樣進(jìn)行平板劃線分離?平板劃線分離的方法發(fā)布日期:2010-09-01瀏覽次數(shù):2021.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法Cufm 冃伯i白 MeUnodiScml-quancllDllva口M«nll 陽(yáng)餌陽(yáng)E p Wmpi 阿卻旬nPDim-d 鐘EM 44平板劃線示例平板劃線示例發(fā)布日期:2010-09-01瀏覽次數(shù):612平板戈U線示例 This is an example of a good stre平板劃線示例This
11、is an example of a good streak for isolati on using the "four corn ers" method.The small colonies here are of Staphylococcus epidermidisThis is not a great streak plate but it is serviceable, as there are a few isolated coloni es. This plate would have been better if the loop had been flam
12、ed betwee n each sector.This is an example of how NOTto streak for isolati on. Scribbli ng is not streak ing, and most likely will not result in isolated coloniesThis plate isolates two differe nt coloni es: Escherichia coli (the cream-colored)coloni es,and Serratiamarcesce ns (the red colo nies).(
13、粘質(zhì) 沙雷菌)This is a plate with Micrococcus luteus 滕黃微球菌,the yellow colonies. While this is a good streak for isolati on, the plate has bee n con tam in ated. The large "fuzzy" colonies are fun gal coloni es.The lid may have been lifted too far away from the plate while streaking,or a draftmay
14、 have caused the spores to fall into the plate.EMB平板原理及照片EM呼板照片及原理發(fā)布日期:2010-05-13瀏覽次數(shù):238This image illustrates the growth of gram-negative bacteria that cannot ferment lactose on eosin methylene blue (This image illustrates the growth of gram-n egative bacteria that cannot ferment lactose on eosin
15、methylene blue (EMB) agar. EMB agar contains bile salts and dyes which in hibit growth of gram-positive bacteria. Growth on EMB agar is a useful diagnostictool to distinguish between lactose fermenters and nonfermenterswhich will appear colorless. This image can be used to describe the use of metabo
16、lism in ide ntificati on of bacteria.Salm on ella and Shigella, both nonl actose ferme ntingpathoge ns, can be dist in guished from the more com monin testi nalflora which ferme ntlactose.Infemb-an.jpg Lactose Nonfermenter on EMBPat Johnson, Palm Beach Community College, Lake Worth, Fla., USA生化試驗(yàn):將斜
17、面培養(yǎng)物移種到下列培1 色氨酸肉湯:在36±C培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.20.3mL, 上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。附:靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片靛基質(zhì)(Indole )試驗(yàn):靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片發(fā)布日期:2010-05-13瀏覽次數(shù):290某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)岀來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基靛基質(zhì)(In dole )試驗(yàn):某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。試驗(yàn)方法:將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管,于36 ± 1
18、C培養(yǎng)24h時(shí)后,取約2ml培養(yǎng)液,加入 Kovacs氏試劑23滴,輕搖試管,呈紅色為陽(yáng)性,或先加少量乙醚或二 甲苯,搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁徐緩加入 Kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈紅色,即為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng),若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取,再加試劑,則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色,因而結(jié)果更為可靠。fl啊Hi作 IraainleWiLh 吧 ladfllej ASM MErobuUbiiry.ang & JohnsonMargaret (Peg) Joh nson. Mesa Co
19、mmu nity College, Mesa, Ariz., USAThis image depicts the results of n egative and positive in dole tests. The in dole test is freque ntly employed to disti nguish Klebsiella or En terobacter bacteria(indolenegative) from Escherichia coli (indolepositive). The presenee of E. coliis used by public hea
20、lth officials as an indicator of fecal contamination of food and water supplies.Prior to this test, En terobacter aeroge nes was used to ino culate one trypt one broth, while ano ther trypto ne broth was in oculated with Escherichia coli. The two broths were the n in cubated for 24 h and mixed with
21、Kovas reage nt (p-dimethylami no-be nzaldehyde).Trypt one broth is rich in the ami no acid tryptopha n.Tryptopha nase, an en zyme, is capable of cleavi ng tryptopha n and produci ng in dole, pyruvic acid, and ammonia. In dole can be detected by the developme nt of a red color after addi ng Kovas rea
22、ge nt. Orga ni sms that do not produce tryptopha nase will be in dole n egative, as no in dole will be prese nt to react with the Kovas reage nt2 MR-VP培養(yǎng)基:在36±C培養(yǎng)48±2h。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物 1 mL 至13m材100mm試管中,加5% a萘酚乙醇溶液0.6mL,40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基
23、紅溶液。如培養(yǎng)物變 紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性,若變黃色則為陰性反應(yīng)。附:MR-VP試驗(yàn)原理及照片MR-VP試驗(yàn)原理及照片發(fā)布日期:2010-05-13 瀏覽次數(shù):224甲基紅(Methyl Red)試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸,進(jìn)一步分解中,由 于糖代謝的途徑甲基紅(Methyl Red )試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸, 進(jìn)一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產(chǎn)生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙
24、酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合 物,稱V P( +)反應(yīng)。大腸桿菌:MR + /VP -3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯:于36±1°C培養(yǎng)96h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。附:枸椽酸鹽利用試驗(yàn)原理及斜面顯色照片枸椽酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片發(fā)布日期:2010-05-13 瀏覽次數(shù):136枸椽酸鹽試驗(yàn):某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源,及磷酸銨作為氮源, 將枸椽酸鹽分解為二氧化碳,培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性,由于枸椽酸鹽試驗(yàn):某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源,及磷酸銨作為氮源,將枸椽酸鹽分解為二氧化碳, 培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性,由于指示
25、劑的作用,培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。說(shuō)明:SN標(biāo)準(zhǔn)所用培養(yǎng)基是肉湯培養(yǎng)基,且不加指示劑,因此,只能觀察是否渾濁生長(zhǎng)。Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO44H2O)1.5g磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g硫酸鎂(MgSO4 7H2O)0.2g枸椽酸鈉(含2H2O)3.0g蒸餾水1000.0mL將各成分溶解于蒸餾水中,分裝試管,每管10 mL,12C高壓滅菌15min。最終pH6.7±0.2。4 LST肉湯:于36 ±1 C培養(yǎng)48 ±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。5革蘭氏染色:取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革 蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿
26、菌生化鑒別如下:菌+ 1-11+1+11-1-1-1-11 1典型大腸桿菌 非典型大腸桿111 1+ 1+ 1- 1 + 1典型中間型-1+ 1- 1 + 1非典型中間型1 111d1 1 +1 +丨典型產(chǎn)氣腸桿菌+ 1 1 +1 +丨非典型產(chǎn)氣腸桿菌11 11如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應(yīng)重新劃線分離,必 要時(shí)做 重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果報(bào)告:大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗(yàn)為+ +或 + ,再根據(jù)LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查MPN表,報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸 桿菌MPN值。第二篇大腸菌群測(cè)定的操作細(xì)則(MPN法)大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需
27、氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以 100mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。1設(shè)備和材料1.1 溫箱:36 ±1 Co1.2冰箱:04 Co1.3 恒溫水?。?4.5 ±.5 Co1.4天平。1.5顯微鏡。1.6均質(zhì)器或乳缽。1.7 平皿:直徑為90mm。1.8試管。1.9吸管。1.10廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。1.11玻璃珠:直徑約5mm。1.12載玻片。1.13酒精燈。1.14試管架。2培養(yǎng)基和試劑2.1乳糖膽鹽發(fā)酵管:按G
28、B 4789.28中4.9規(guī)定。22伊紅美藍(lán)瓊脂平板:按GB 4789.28中4.25規(guī)定。2.3乳糖發(fā)酵管:按GB 4789.28中4.10規(guī)定。2.4 EC 肉湯:按 GB 4789.28 中 4.11 規(guī)定。2.5磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB 4789.28中3.22規(guī)定。2.6生理鹽水。2.7革蘭氏染色液:按GB 4789.28中2.2規(guī)定。3操作步驟3.1檢樣稀釋3.1.1以無(wú)菌操作將檢樣 25mL(或g)放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃 瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器,以8 000-10 0
29、00 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。3.1.2用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的 試管內(nèi),振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。3.1.3另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支 1mL滅菌吸管。3.1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì),選擇三個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度,接種3管。3.2乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。 每一稀釋度接種3管,置36±1 C溫箱內(nèi),培養(yǎng)2
30、4±2h, 如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報(bào)告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)氣者,則按下列程序進(jìn)行。3.3分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置36±1 C溫箱內(nèi),培養(yǎng)18-24h,然后取出,觀察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。3.4證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管,置36±1C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌,即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。3.5報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù),查MPN檢索表,報(bào)告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。4 糞大腸
31、菌群(faecal coliform)4.1用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物(見3.2條)轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi),置44.5 ±0.2 C水浴箱內(nèi) 冰浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面),培養(yǎng)24±2h,經(jīng)培養(yǎng)后,如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣,則可報(bào)告為陰性;如有產(chǎn)氣者,則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美 藍(lán)瓊脂平板上,置 培養(yǎng)18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。4.2結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù),查MPN檢索表,報(bào)告每100mL(g)糞大腸菌群 的 MPNS。第三篇出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法Method for e
32、xamination of coliform , fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 92代替 ZB X09 002 861 主題內(nèi)容與適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗(yàn)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料2.1吸管:1mL,具O.ImL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。2 2 水浴箱:44.5 ±5C。2.3 培養(yǎng)箱:36±C, 44.5 ±.5 C。2.4冰箱:05C和-15-20 C。2.5 均質(zhì)器。2.6 乳缽和研棒。
33、2.7 平皿:直徑 90mm。2.8 天平:感量 0.1g。2.9 顯微鏡。2.10 稀釋瓶: 100mL、200mL 和 500mL 三角燒瓶及廣口瓶。2.11 玻璃珠:直徑約 5mm。2.12 菌落計(jì)數(shù)器。3 培養(yǎng)基及試劑3.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白 (LST) 肉湯。3.2 煌綠乳糖膽鹽 (BGLB) 肉湯。3.3 EC 肉湯。3.4 伊紅美藍(lán)瓊脂 (EMB) 。3.5 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。3.6 色氨酸肉湯。3.7 MR-VP 培養(yǎng)基。3.8 Korser 氏枸椽酸鹽肉湯。3.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 (VRBA) 。3.10 Butterfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液。3.11 生理鹽水。3
34、.12 革蘭氏染色液。3.13 Kovacs 氏靛基質(zhì)試劑。3.14 甲基紅指示劑。3.15 Voges pros kauer(V P)試劑。4 樣品制備4.1 以無(wú)菌操作取有代表性的樣品。 如有包裝則用 75 乙醇在開口處擦拭后取樣。 若不能及時(shí)檢驗(yàn),應(yīng)將冷凍樣品置于 -15 C保存;非冷凍而易腐的食品,應(yīng)置于4 C冰箱保存。檢驗(yàn)前冷凍樣品可于 2 5 C 18h內(nèi)解凍,或在 45 C以下15min內(nèi)解凍。4.2 不同食品樣品勻液的制備4.2.1 液體食品以滅菌吸管取樣 25mL 放入裝有 225mL 稀釋劑的滅菌玻璃瓶 (瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠 ), 以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖25次(
35、或以機(jī)械振蕩器振搖),制成1: 10的樣品勻液。4.2.2 固體和半固體食品以無(wú)菌操作取25g樣品,放入裝有 225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000r/min均質(zhì)12min,制成1: 10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。4.3 稀釋樣品勻液根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì), 用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如 10-2、10-3、10-4.。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過(guò)程不得超過(guò)15min。5 大腸菌群的測(cè)定5.1 大腸菌群 MPN 值的測(cè)定5.1.1 對(duì)每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白 (LST) 肉湯,每管接種
36、1mL。5.1.2將接種管置于 36±1 C培養(yǎng)48±h。5.1.3觀察試管的產(chǎn)氣情況:檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有 LST 肉湯管均未產(chǎn)氣,則可報(bào)告為大腸菌群陰性;如有產(chǎn)氣者,則進(jìn)一 步作證實(shí)試驗(yàn)。5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)5.2.1將所有產(chǎn)氣管用直徑為 3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽 (BGLB)肉湯管中。5.2.2置BGLB肉湯管于 36±1C培養(yǎng)48±2h。5.2.3 記錄所有 BGLB 肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。5.2.4結(jié)果報(bào)告:按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù),查 MPN表(見附錄B(補(bǔ)充件)報(bào)告每克(毫升)
37、樣 品中大腸菌群的 MPN 值。6 糞大腸菌群測(cè)定6.1用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于 EC肉湯管中。6.2將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5 ±.5C水浴箱內(nèi),培養(yǎng) 24±2h。水浴 箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。 應(yīng)以已知為44.5 C產(chǎn)氣陽(yáng)性的大腸桿菌和 44.5 C不產(chǎn)氣 的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。6.3 記錄 EC 肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽(yáng)性;不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試 驗(yàn)陰性。6.4 結(jié)果報(bào)告:按產(chǎn)氣管數(shù),查 MPN 表報(bào)告每克 (毫升)樣品中糞大腸菌群的M
38、PN 值。7 大腸桿菌測(cè)定7.1將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng) 24h,取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板,36±1C培養(yǎng)24+2ho7.2 檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。7.3 如有典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取 2 個(gè)典型菌落;如無(wú)典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1C培養(yǎng) 1824h。7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。7.4.1色氨酸肉湯:在 36 ±1 C培養(yǎng)24±2h后,力口 Kovacs氏試劑0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅
39、色 為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。7.4.2 MR VP培養(yǎng)基;在36 ±1 C培養(yǎng)48±2h。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物 1mL至13mnX 100mm 試管中,加5%a萘酚乙醇溶液0.6mL , 40%氫氧化鉀溶液 0.2mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖 試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為 VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性,若變黃色則為陰性反應(yīng)。743 Koser氏枸椽酸鹽肉湯:于36±C培養(yǎng)96h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。744 LST肉湯:于30 ±1 C培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。745革蘭氏
40、染色:取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下:靛基質(zhì)MRVP枸椽酸鹽鑒定(型別)+ +-典型大腸桿菌- +-非典型大腸桿菌+ +-+典型中間型- +-+非典型中間型- -+典型產(chǎn)氣腸桿菌+ -+非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純, 應(yīng)重新劃線分離, 必要時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)。7.5 結(jié)果報(bào)告:大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC 試驗(yàn)為 +-或-+- ,再根據(jù) LST 肉湯陽(yáng)性管數(shù)查 MPN 表,報(bào)告每克 (毫升)樣品中大腸桿菌 MPN 值。8 大腸菌群固體培養(yǎng)基測(cè)定法8.1 樣品
41、制備同第 4章。8.2 計(jì)數(shù)8.2.1選取適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品液,每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)滅菌平皿,每皿1mL。另取 lmL 稀釋劑加入一個(gè)滅菌平皿中,作空白對(duì)照。8.2.2將冷至45±0.5C的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 (VRBA)1015mL傾注于每個(gè)平皿中。小心 旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。8.2.3 待瓊脂凝固后,再加 34mLVRBA 覆蓋平板表層。8.2.4翻轉(zhuǎn)平板,置于 36±C培養(yǎng)1824h。8.2.5 選用有 30 150個(gè)菌落的平板,計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落。典型菌落為紫 紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為 0.5mm 或更大。8.2
42、.6 證實(shí)8.2.6.1 從 VRBA 平板上挑取 10 個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,移種于 BGLB 肉湯管內(nèi), 36 ±1 C培養(yǎng)24h和48h,觀察產(chǎn)氣情況。8.2.6.2 將出現(xiàn)產(chǎn)氣的肉湯管判為大腸菌群陽(yáng)性。對(duì)形成菌膜的陽(yáng)性管,應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色, 以便排除革蘭氏陽(yáng)性桿菌。8.2.7 結(jié)果報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為陽(yáng)性 (產(chǎn)氣,革蘭氏陰性桿菌 )的試管百分比乘以于 8.2.5 條中計(jì)數(shù)的平板菌落 數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每克(毫升 )樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液ImL,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB 肉湯管,證實(shí)有 6個(gè)陽(yáng)性管,則該樣品的
43、大腸菌群數(shù)為:100X6/ 10X104/g(mL) = 6.0 >105/ g(mL)附 錄 A培養(yǎng)基和試劑(補(bǔ)充件 )A1月桂基硫酸鹽胰蛋白(LST)肉湯胰蛋白 或胰酪胨 (Trypticase)20g氯化鈉5.0g乳糖 5.0g磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 2.75g 磷酸二氫鉀 (KH2P04) 2.75g 月桂基硫酸鈉 0.1g蒸餾水 1000.0mL將各成分溶解于蒸餾水中。高壓滅菌15min。最終pH6.8±0.2。A2 煌綠乳糖膽鹽 (BGAB) 肉湯蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛膽粉 (oxgall 或 oxbile) 溶液200.0mL0. 1 煌綠水溶
44、液13.3mL蒸餾水將蛋白胨乳糖溶于約 500mL 蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200mL蒸餾水中,pH7.07.5),用蒸餾水稀釋到 975mL ,分裝到有倒立發(fā)酵管的 20mm150mm試管中,每管10mL°12lC液13.3mL,用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL,用棉花過(guò)濾后,分裝到121 C高壓滅菌15min。最終立的小發(fā)酵管 )中,每管10mL。A3 EC 肉湯胰蛋白 或胰酪20.0g3 號(hào)膽鹽或混合膽鹽1.5g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(KH2P04)4.0g磷酸二氫鉀(KH2P04)1.5g氯化鈉5.0g蒸餾水1000.0mL將以上成分溶解于蒸餾水中,200mL( 將 20.0g 脫
45、水牛膽粉溶于pH7.4。再加入20mmm l50mmpH7.2±0.1 。0.1 煌綠水溶試管 (管內(nèi)有倒分裝 16mmm 150mm 試管(管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管),每管 8mL。121 C 高壓滅菌 15min,最終 pH6.9 ±1。1。A4 伊紅美藍(lán)瓊脂 (EMB)蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀 (KH2P04)2.0g瓊脂15.0g伊紅丫水溶性)0.4g或2%水溶液20mL美藍(lán) 0.065g 或 0.5水溶液13mL蒸餾水1000.0mL在 1 000mL 蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂,加水補(bǔ)足至原量。分裝于三角燒瓶中。每瓶100mL或200mL
46、,高壓滅菌15min。最終pH7.1 ±0.2。使用前將瓊脂融化,于每 100mL瓊脂中加5mL滅菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊紅丫水溶液和1.3mL0.5 %的美 藍(lán)水溶液,搖勻,冷至4550 C傾注平皿。A5 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g瓊脂15.0g蒸餾水 1000.0mL將各成分加于蒸餾水中, 煮沸溶解。分裝合適的試管。121 C高壓滅菌15min。最終pH7.3±0.1。 滅菌后擺成斜面?zhèn)溆?。A6 色氨酸肉湯胰胨或胰酪胨 10.0g蒸餾水 1000.0mL加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管,每管5mL。121 C高壓滅菌15min。最終
47、 pH6.9±0.2。A7 MR-VP 培養(yǎng)基胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀 (K2HPO4)5.0g蒸餾水1000.0mL將各成分溶于蒸餾水中,分裝試管,121 C高壓滅菌15min,最終pH6.9±0.2。A8 Koser 氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫銨鈉 (NaNH4HPO4?4H2O) 1.5g磷酸氫二鉀 (K2HPO4)1.0g硫酸鎂 (MgSO4?7H2O)0.2g枸椽酸鈉 (含 2H2O)3.0g蒸餾水1000.0mL將各成分溶解于蒸餾水中,分裝試管,每管10mL, 121 C高壓滅菌15min。最終pH6.7±0.2。A9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 (VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖 10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或 3 號(hào)膽鹽1.5g中性0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂1518g蒸餾水1000.0mL將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢瑁{(diào)至pH7
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