斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)_第1頁
斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)_第2頁
斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)_第3頁
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1、斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)探針的標(biāo)記：取DNA 2ug于20ul水中，于沸水中煮沸變性10 分鐘，迅速放入冰中，5 分鐘。加入4ulprime混合物，37°C過夜，加 0.5M EDTA 1ul終止反應(yīng)，保存于20° C 冰箱中備用。點(diǎn)膜：樣品 DNA ： 50ng/dot2ul/dot陰性對(duì)照魚精 DNA ： 50ng/dot2ul/dot （濃度 5mg/ml1:200 稀釋）變性： 1NNaOH 30 分鐘中和： 0.6MNaCl 、1M Tris HClpH7.215 分鐘 x13MNaCl 0.5MTris-HCl15 分鐘 x1漂洗： 2XSSC 迅速漂洗一次。將膜夾濾紙中，

2、120° C 烤 30分鐘。用保鮮膜包好，于4° C 冰箱備用。預(yù)雜交：預(yù)雜交液去離子甲酰胺10ml20xSSC5ml0.4M PB1ml50x denhardts5ml魚精 DNA （變性）0.4ml （ 5mg/ml ）膜于雜交管中，加入預(yù)雜交液，于雜交儀中42°C35 小時(shí)。雜交：雜交液的配制：標(biāo)記好的探針DNA 、魚精 DNA 于 100° C 沸水中變性，置冰中 10 分鐘待用。去離子甲酰胺20xSSC0.4M PB50x denhardts魚精 DNA （變性）雙蒸水補(bǔ)探針 DNA （變性）10ml5ml1ml0.4ml0.4ml （ 5mg/ml ）4ml20ul于 42°C 雜交過夜。漂洗：62° C2× SSC-0.1% SDS0.1×SSC-0.1%SDS0.1×SSC(以下步驟于0.05MTris.HCl151515 0.12MNaCl系統(tǒng)中,均在室溫)封閉：封閉液1ml（5% 脫脂奶粉） 0.5 1 小時(shí)漂洗：用 0.05M Tris.HCl 0.12M NaCl1ml 漂洗1× 10抗體： 1ml 1-2小時(shí)（ 1： 3000-1:10000）漂洗：用 0.05M Tris.HCl 0.12M NaCl漂洗3(

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