黃芩酶解最佳工藝條件的正交實驗篩選(1)

1、黃芩酶解最佳工藝條件的正交實驗篩選(1)    【關(guān)鍵詞】 正交設(shè)計；,黃芩；,酶解；,黃芩苷摘要：目的以黃芩苷為指標(biāo)，優(yōu)化黃芩酶解提取的最佳工藝條件。方法運用正交設(shè)計篩選酶解參數(shù)。以高效液相色譜法測定黃芩苷，并計算其收率。結(jié)果當(dāng)復(fù)合酶用量為底物的1，保溫沉淀時間1.5 h，提取溫度50，提取時間2 h時，黃芩苷收率達(dá)17.2%。結(jié)論 在優(yōu)化的酶解條件下，黃芩苷的收率最高。該研究為黃芩苷提取物的制備提供了一種新方法。關(guān)鍵詞：正交設(shè)計； 黃芩； 酶解； 黃芩苷The Optimum Extraction Technology of Baicalin fro

2、m Radix Scutellaria by Enzymatic Hydrolysis Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of baicalin from Scutellaria baicalensis on the condition of enzymatic hydrolysis.MethodsTo optimize by the orthogonal design，and to determine the content of baicalin by HPLC.ResultsThe optimum extractio

3、n condition was obtained as follows: the ratio of enzyme/substrate was 1%, the time of enzymatic hydrolysis was 2h at the extraction temperature of 50, and kept at 80 for 1.5h after adjusting the pH value to 2.0. ConclusionThe new method is developed for preparing the baicalin extract. Key words：Ort

4、hogonal design; Scutellaria baicalensis Geo.; Enzymatic hydrolysis; Baicalin     黃芩為唇形科植物Scutellaria baicalensis Geo.的干燥根，性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃芩苷(baicalin)是黃芩中的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明：黃芩苷具有清熱解毒、抗炎利膽、保肝、抗氧化和抗腫瘤等功能，在臨床上被廣泛應(yīng)用1。中藥材有效成分往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，在藥用植物有效成分提取過程中，選用適當(dāng)?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧?，可以使?xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維

5、素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)降解，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，減小細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從而有利于有效成分的溶出2。目前，黃芩苷的提取工藝多以水提為主，運用生物酶解進(jìn)行提取的報道不多。為尋找酶解提取最佳工藝、提高黃芩苷的產(chǎn)率和純度、減輕后處理的負(fù)擔(dān)，本文運用正交設(shè)計全面考察了酶用量、提取時間和溫度、保溫沉淀時間等因素及其交互作用對黃芩苷收率的影響。1 材料與方法1.1 儀器美國安捷倫公司Agilent 1100型高效液相色譜儀(包括四元泵,真空脫氣機(jī),自動進(jìn)樣器,柱溫箱DAD檢測器) , Agilent 1100化學(xué)工作站；上海安亭科學(xué)儀器廠Anke LX

6、J-B型離心機(jī)；上海躍進(jìn)醫(yī)學(xué)儀器廠數(shù)顯式恒溫水浴鍋。1.2 藥材及試劑提取用復(fù)合酶（內(nèi)含纖維素酶136萬u/ml，半纖維素酶15萬u/ml，果膠酶160萬u/ml，-葡萄糖酶0.8萬u/ml）為寧夏和氏璧生物有限公司生產(chǎn)；黃芩苷對照品(自制，HPLC歸一化法計算其含量大于98%)；生藥黃芩的干燥根(產(chǎn)地為青島膠南黃芩GAP產(chǎn)業(yè)基地)，經(jīng)青島市煒倫生物技術(shù)有限公司汪志仁藥師鑒定為唇形科植物Scutellariabaicalensis Geo.的干燥根。甲醇為色譜純，水為超純水，醋酸為分析純。1.3 方法1.3.1 黃芩藥材前處理由于黃芩中黃芩苷酶的存在，提取前若未先除酶，濕潤下的黃芩粉在32恒溫

7、5 h，則黃芩苷完全酶解，形成很不穩(wěn)定的鄰三羥基黃酮，極易氧化變成綠色醌類衍生物，影響黃芩苷含量的提取3。本實驗采用的復(fù)合酶最佳提取溫度為2555。為此，在進(jìn)行實驗前宜先將黃芩原藥材粉碎，通過熱蒸氣加熱30 min,以便“殺酶保苷”，避免原料中黃芩苷酶對黃芩苷提取的影響。1.3.2 黃芩酶解工藝步驟將黃芩藥材粉碎后，通過熱蒸氣加熱30 min滅酶，再加入10倍水和適量的復(fù)合酶，按表1和表2設(shè)計的技術(shù)參數(shù)提取。將提取液轉(zhuǎn)移至離心杯中，5 000 r/min離心15 min，取上清液，加鹽酸調(diào)pH值為2，在80保溫，使黃芩苷析出。過濾，沉淀物用水洗至pH=5.0,凍干，即得黃芩苷粗提物。1.3.3

8、 正交實驗設(shè)計方案4因素水平見表1。表1 黃芩酶解工藝因素水平（略）1.4 黃芩苷含量測定51.4.1 色譜條件 色譜柱 BECKMAN C18(4.6 mm×250 mm,5 m)；流動相為甲醇水醋酸47530.2；流速1.0 ml/min，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量10 l。1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，于25 ml容量瓶中加甲醇溶解、定容。再分別取2，4，5，6，8 ml置于10 ml容量瓶加甲醇至刻度。分別取10 l，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及線性范圍為：Y=3&

9、#215;106X 1 517.4（r=0.999 3）。2 結(jié)果正交實驗結(jié)果見表2。由表2可以看出，影響黃芩苷收率的因素依次為：D>A>C>B（極值R的排列順序）。黃芩苷最佳酶解工藝為表2中的第2號實驗：A1B2C2D2 ，即酶用量為底物的1，加熱提取溫度50，提取時間2 h，保溫沉淀時間1.5 h時，可得到最大的黃芩苷收率（17.2）。表2 酶解黃芩工作安排表（略）黃芩苷收率（%）=100（黃芩粗提取物的質(zhì)量×黃芩粗提物中黃芩苷百分含量）/黃芩提取前質(zhì)量3 討論本文針對酶解工藝在黃芩提取的實際應(yīng)用中運用較少、工藝不成熟的現(xiàn)狀，將酶解工藝引入到黃芩的提取中，應(yīng)用含有多種酶的復(fù)合酶，充分發(fā)揮酶解優(yōu)勢，對黃芩的酶解提取進(jìn)行了研究。運用正交實驗確定了黃芩苷最佳酶解工藝。為黃芩酶解工藝的中試放大提供了一定的參考依據(jù)，但由于投料量較少，在實際生產(chǎn)中還有待驗證。此外，由于黃芩自身的酶解，第1步采用蒸氣加熱以“殺酶保苷”是必要的。在提取中本文沒有進(jìn)行二次提取，主要是考慮到在實際生產(chǎn)中一般均不采用二次提取，同時也是為了便于酸沉淀、抽濾、洗酸等工藝過程。因為洗酸過程要反復(fù)進(jìn)行34次，本方法可以縮短生產(chǎn)周期和減少酸的用量，提高酶解工藝的實用性。黃芩苷2上的羥基易成鹽，在酸性條件下黃芩苷分子就被還