表面活性劑增敏熒光光度法測定牛奶中的三聚氰胺

1、第38卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究簡報第2期2010年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry249252DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00249表面活性劑增敏熒光光度法測定牛奶中的三聚氰胺黃暉李麗馬喬馮鈺锜何治柯3(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室,武漢)摘要性劑(CTMAB)對三聚氰胺熒光強(qiáng)度的增敏作用,在pH.2MAB為增敏劑,測定三聚氰胺,線性范圍為251000g/L,1.6%。按國標(biāo)方法處理樣品,采用本法測定,回收率偏高;,實際樣品檢測獲得滿意結(jié)果。此方法簡便、快捷。關(guān)鍵詞;三聚氰胺;熒

2、光光度法;固相萃取整體柱1引言三聚氰胺(Melamine,M)對人和動物造成的危害已引起廣泛關(guān)注。2008年10月我國發(fā)布的公告規(guī)定:嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg;液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三12聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。目前,三聚氰胺的檢測方法主要有:液相色譜法(HPLC)、液相色3,456譜2質(zhì)譜法(HPLC2MS)、氣相色譜2質(zhì)譜法(GC2MS)和毛細(xì)管電泳等。針對這些方法,國家質(zhì)檢總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會批準(zhǔn)發(fā)布的原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測方法中,高效液相色譜7法的定量限為2mg/kg,液相色譜2質(zhì)譜/質(zhì)譜法的定量限為0.01mg/kg。

3、但上述檢測方法均需使用大810型儀器,且操作繁瑣。固相萃取整體柱與被分析物之間的選擇萃取作用已得到廣泛應(yīng)用。本研究利用三聚氰胺在弱堿性介質(zhì)中能產(chǎn)生熒光,表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)的增敏作用,22丙烯酰胺222甲基212丙磺酸2乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合物(AMPS2co2EDMA)固相萃取整體柱對三聚氰胺良好的富集分離作用,采用整體柱對牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理,實現(xiàn)了實際樣品的準(zhǔn)確檢測。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物,其分子中含有共軛雙鍵(鍵)結(jié)構(gòu),及3個給電子取代基NH2,其激發(fā)態(tài)由環(huán)外氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上而產(chǎn)生。由于它們n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上軌道平行,因而實際

4、上它們共享了共軛電子結(jié)構(gòu),擴(kuò)大了其共軛雙鍵體系,故具有熒光特性,在非極性的介質(zhì)中,它的熒光較弱,隨著介質(zhì)極性的提高,其熒光強(qiáng)度也隨之增大,當(dāng)它處于酸性介質(zhì)中時,取代基NH2會質(zhì)子化為NH3,熒光強(qiáng)度明顯減弱,甚至無熒光發(fā)生;而在弱堿性介+質(zhì)中,其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。據(jù)此建立了熒光分光光度法測定牛奶中三聚氰胺的方法。本方法適用于牛奶樣品中三聚氰胺的快速初篩及檢測。2實驗部分2.1儀器與試劑RF25301pc熒光分光光度計(Shimadzu公司),LS55熒光分光光度計(PerkinElmer公司),PB210酸度計(Sartorius公司),TGL216G高速離心機(jī)(北京澤祥恒達(dá)科技發(fā)展公司),K

5、Q2200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),S25渦旋儀(IKA公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE25299(鞏義市英峪高科儀器廠),TS2260雙重注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。三聚氰胺,Tris(Sigma公司),Brij35(Acros公司),十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)、十二烷基苯磺酸鈉(DDBS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙腈、正己烷,三氯乙酸,HCl和NaOH均為分析純試劑,Tris2HCl緩沖體系(pH=8.0),水為Milli2Q超純水。2009206223收稿;2009208228接受本文系國家自然科學(xué)基金(Nos.90717111,20621502)資助項目3E2ma

6、il:zhkhe250分析化學(xué)第38卷2.2實驗方法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制三聚氰胺(M)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:精確稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品,配成質(zhì)量濃度為1.000g/L的儲備液。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制濃度為10mg/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。2.2.2熒光強(qiáng)度的測定在塑料離心管中依次加入2mLTris2HCl緩沖溶液、1.0mLCTMAB溶液、0.2mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,加入超純水定容至4mL,室溫超聲10min,放置5min后,測定熒光強(qiáng)度。處理樣品。在離心管中分別準(zhǔn)確移取1mL牛奶樣品,加入5mLHCl酸化乙腈(pH=2.0),超聲10min,使蛋白質(zhì)沉淀,以r/min轉(zhuǎn)移合并上清液

7、,向上清液中多次加入20mL正己烷,振蕩,靜置,將下層清液2.2.3樣品制備方法1按國標(biāo)法7減壓蒸干,水溶,用微孔濾膜過濾得清液備用;方法2品。在離心管中分別準(zhǔn)確移取1mL,5(pH=3.0),渦旋1min,超聲10min,使蛋白質(zhì)沉淀,以8000r/m,用0.22m微孔濾膜過濾得待凈化液。(本實驗室研制)中,用TS2260雙重注射泵,以100L/min,再用5%氨化甲醇洗脫,洗脫液于50下氬氣吹干,殘留物用水定容,1min,過0.22m微孔濾膜后,供測定用。73結(jié)果與討論3.1M2CTMAB體系的熒光光譜比較陽離子表面活性劑CTMAB、陰離子表面活性劑DDBS、SDS、非離子表面活性劑Bri

8、j35等表面活性劑對三聚氰胺熒光強(qiáng)度的增敏作用,發(fā)現(xiàn)表面活性劑CTMAB增敏效果較好。按2.2.2實驗方法進(jìn)行實驗,得到M2CTMAB體系熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(圖1)。由圖1可見,在pH=8.0的Tris2HCl緩沖溶液中,M2CTMAB體系有2個激發(fā)峰,分別位于234和280nm,最大激發(fā)波長為234nm。在此波長激發(fā)下,三聚氰胺體系在345nm處有一個熒光峰(曲線3),以表面活性劑CTMAB增敏后,此處的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(曲線2)。3.2緩沖體系酸度和緩沖溶液用量對M2CTMAB體系熒光強(qiáng)度的影響圖1M2CTMAB體系的激發(fā)光譜(1),發(fā)射光分別將pH4.58.5的磷酸鹽緩沖溶液、pH7

9、.0()MAB增敏時的發(fā)射光譜(3)1015的Tris2HCl緩沖溶液、HCl溶液(pH為0,1,2)和譜2和無CTFig.1FluorescentexcitationspectraofmelamineNaOH溶液(pH為12,13,14)2mL加入M2CTMAB體系中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在pH<6.5的酸性體系中,M2CTMAB體系melamineinbuffersolutionswithCTMAB(2)and無熒光;在NaOH堿性體系中,熒光強(qiáng)度較弱;在磷酸鹽緩withoutCTMAB(3)沖體系中,當(dāng)pH>7.0時,在345nm處有較強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光峰;Tris2HCl緩沖體系中,當(dāng)p

10、H>7.5時,在345nm處也有較強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光峰,且熒光強(qiáng)度比磷酸鹽緩沖體系強(qiáng)(圖2)。同時比較了pH=8.0的硼酸2NaOH、硼砂2HCl、KH2PO42硼砂緩沖溶液體系,其熒光強(qiáng)度均低于Tris2HCl緩沖體系,故實驗選擇pH=8.0的Tris2HCl緩沖體系。取不同體積的pH=8.0的Tris2HCl緩沖溶液,按2.2.2實驗方法進(jìn)行實驗,結(jié)果如圖3。從圖3可知,當(dāng)緩沖溶液用量大于1.2mL時,熒光強(qiáng)度最大且趨于穩(wěn)定,實驗選擇pH=8.0的Tris2HCl緩沖溶液用量為2mL。3.3表面活性劑種類和用量及離子強(qiáng)度對熒光強(qiáng)度的影響考察陽離子表面活性劑CTMAB、陰離子表面活性劑DD

11、BS、SDS、非離子表面活性劑Brij35對三聚氰胺熒光強(qiáng)度的增敏作用。實驗發(fā)現(xiàn),陰離子表面活性劑DDBS和SDS不能增強(qiáng)三聚氰胺熒光強(qiáng)度,陽離子表面活性劑CTMAB和非離子表面活性劑Brij35均對三聚氰胺熒光有增敏作用,但CTMAB的增敏作用略強(qiáng),故選用CTMAB為增敏劑。改變CTMAB用量(0.10,0.25,0.50,0.75,1.0和1.25mL),按2.2.2的實驗方法進(jìn)行實驗。當(dāng)CTMAB用量在0.5mL以上,熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定(F190),故實驗(M)2CTMAB(1),fluorescentemissionspectraof第2期黃暉等:表面活性劑增敏熒光光度法測定牛奶中的三聚

12、氰胺251圖2pH對M2CTMAB體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.2EffectofpHonfluorescenceM2CTMAB23quantityofbuffersolutiononfluorescenceofM2CTMAB.0實驗發(fā)現(xiàn),在相對誤差±5.00%范圍內(nèi),加入0.5mL2mol/LNaCl3.4M2CTMAB體系的超聲時間和體系的穩(wěn)定時間改變超聲時間進(jìn)行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在室溫條件下,超聲時間超過3min,體系的熒光強(qiáng)度已基本穩(wěn)定。為了使M2CTMAB體系更穩(wěn)定,選擇超聲時間為10min;在030min內(nèi)對已超聲10min的M2CT2MAB體系熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)M2CTM

13、AB體系熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。為實現(xiàn)快速測定三聚氰胺,本實驗選擇超聲后放置5min測定。將體系放置2h后測定,體系熒光強(qiáng)度依然穩(wěn)定。3.5工作曲線和檢出限按優(yōu)化條件測定不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果如圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:F=0.2552c(g/L)2+64.754,r=0.9995。式中F為熒光強(qiáng)度,C為溶液濃度,線性范圍為251000g/L。對空白溶液進(jìn)行9次測量,以其標(biāo)準(zhǔn)偏差3倍除以斜率得出該方法的檢出限19g/L。對500g/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液9次平行測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%。圖4不同含量M存在下體系的熒光光譜3.6共存物質(zhì)的干擾Fig.4EmissionspectraofM2CTMA

14、Binbuffersolutions當(dāng)三聚氰胺溶液濃度為500g/L,相對誤差±5.00%范圍內(nèi),考察發(fā)現(xiàn),牛奶中一些常見物質(zhì)對2+2+33+2+三聚氰胺測定的最大允許倍數(shù)分別是:Ca(300),Mg(300),K(4.16×10),Fe(25),Cu4(40),Zn2+(400),乳糖(1.43×10),維生素C(25)。干擾實驗結(jié)果表明,上述共存物質(zhì)允許倍數(shù)均大于其在牛奶中的相對值,實際測定中不會對三聚氰胺的測定造成干擾。3.7樣品分析withdifferentconcentrationsofM采用兩種方法分別對奶樣進(jìn)行前處理,并進(jìn)行測定,均未檢出三聚氰胺。對

15、樣品進(jìn)行各個濃度水平的加標(biāo)回收率測定,結(jié)果如表1所示。對兩種樣品預(yù)處理的方法進(jìn)行比較,可以看出,方法1中,樣品的表1樣品加標(biāo)回收率Table1Recoveriesofspikedsample序號No.123加入量Added(g/L)25125250方法1Method1測量值回收率Found(g/L,n=6)27.6131.8262.4Recovery(%,n=6)110.3105.4105.0RSD(%)3.2.2.823序號No.123加入量Added(g/L)25125250方法2Method2測量值回收率Found(g/L,n=6)23.7121.8250.5Recovery(%,n=6

16、)94.797.4100.2RSD(%)6.4.3.574252分析化學(xué)第38卷加標(biāo)回收率均高于實測值,易導(dǎo)致實際樣品測定過程中出現(xiàn)假陽性,造成較大誤差;方法2使用固相萃取整體柱進(jìn)行預(yù)處理,樣品的平均回收率接近實際加入量,避免假陽性的產(chǎn)生,提高了方法的可行性。本方法樣品前處理簡單,分析時間短,不需使用大型儀器,且經(jīng)濟(jì)環(huán)保?？捎糜诖罅颗Ｄ虡悠分腥矍璋返目焖俪鹾Y及檢測。References1BulletinNo.25ofMinistryofHealthofP.R.China,MinistryofIndustryandInformationofP.R.China,MinistryofAgricul

17、tureofP.R.China,StateAdministrationforI&ministra2tionofQualitySupervision,InspectionandQuarantineofP.BLimitationofMelamineinMilkandtheDairyProducts)衛(wèi)生部、2008年第25號(關(guān)于乳與乳制品)p:2Muiz2os2SG,Rosales2martinezD,Gonzalo2LumbrerasR,Santos2MontesA,Cubedo2Fernandez2TrapiellaA,IRC.Anal.Bioanal.Chem.,2008,392(

18、3):5235313AndersenWC,TurnipseedSB,KarbiwnykCM,ClarkSB,MadsonMR,GiesekerCM,MillerRA,RummeNGL,ReimschuesselR.J.Agric.FoodChem.,2008,56(12):434043474LIAi2Jun(李愛軍),ZHANGDai2Hui(張代輝),MAShu2Min(馬書民),LIMing(李明),ZHANGXiu2Zhen(張秀珍),YAOTian2Ling(姚天靈).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化學(xué)),2008,36(5):6997015WUHui2Qin(吳惠勤),

19、HUANGFang(黃芳),LINXiao2Shan(林曉珊),DENGXin(鄧欣),MAYe2Fen(馬葉芬),HUANGXiao2Lan(黃曉蘭),ZHUZhi2Xin(朱志鑫),LUOHui2Tai(羅輝泰).ChineseJ.InstrumentalAnalysis(分析測試學(xué)報),2008,27(10):104410486RAOQin2Xiong(饒欽雄),TONGJing(童敬),GUOPing(郭平),LIHai2Yan(李海燕),LIXiao2Wei(李曉薇),DINGShuang2Yang(丁雙陽).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化學(xué)),2009,37(9):

20、134113447GB/T2238822008.DeteminationofMelamineinRawMilkandDairyProducts(原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法).NationalstandardsofP.R.China(中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn))8ZhengMM,ZhangMY,FengYQ.J.Sep.Sci.,2009,32(11):196519749YINHong2Rui(尹宏瑞),MAQiao(馬喬),FENGYu2Qi(馮鈺锜).J.Anal.Sci.(分析科學(xué)學(xué)報),2009,25(1):172010HUANGJing2Fang(黃京芳),FENGYu2Qi(馮鈺锜

21、),LINXing2Hua(林幸華).Chin.Pharm.J.(中國藥學(xué)雜志),2009,44(12):941945DeterminationofMelamineinMilkbyFluorescentSpectrophotometrywithCetyltrimethylammoniumBromideHUANGHui,LIli,MAQiao,FENGYu2Qi,HEZhi2Ke3(KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforBiologyandMedicine,MinistryofEducation,CollegeofChemistryandMolecularSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072)AbstractMelamineisakindoftriazinecompoundandthe