動物檢疫學(xué)講義課件

1、第一章 動物檢疫學(xué)概論第一節(jié) 動物檢疫概述一、動物檢疫的定義動物檢疫（quarantine）是遵照國家法律，運用強制性手段和科學(xué)技術(shù)方法對動物、動物產(chǎn)品、運載工具等進行疫病方面的檢查，并采取相應(yīng)措施預(yù)防或阻斷動物疾病的發(fā)生、流行以及從一個地區(qū)向另一個地區(qū)之間的傳播。三、動物檢疫的意義和作用1.保護動物生產(chǎn) 2.促進經(jīng)濟貿(mào)易活動的開展 3.保護人類健康 4.保障消費者使用合格的動物及動物產(chǎn)品 四、動物檢疫的基本屬性1.法制性 2.預(yù)防性 3.國際性 4.綜合性五、動物檢疫的內(nèi)容 （一）檢疫性疫病動物檢疫實質(zhì)是檢出引起動物疾病特別是傳染病、寄生蟲病的病原體以及其他有害生物。（二）檢疫物1、動物、動

2、物產(chǎn)品和其他檢疫物 2、運載工具和器物其他檢疫物包括動物血清、動物廢棄物（分泌物、排泄物、滲出物以及脫落的皮屑、毛發(fā)等）、動物疫苗、動物飼料等。六、動物檢疫法規(guī)（一）主要國際動物檢疫相關(guān)組織及法規(guī)1、相關(guān)組織：有世界貿(mào)易組織（WTO）和國際獸疫局（OIE）。2、主要法規(guī)：與動物檢疫相關(guān)的國際性法規(guī)主要有SPS協(xié)定和國際動物衛(wèi)生法典。（二）中國有關(guān)動物檢疫法規(guī)目前，主管我國動物檢疫的國家機關(guān)是國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和農(nóng)業(yè)部，涉及我國動物檢疫的主要法規(guī)包括中華人民共和國動物防疫法、中華人民共和國進出境動植物檢疫法、中華人民共和國進出境動植物檢疫法實施條例、中華人民共和國禁止攜帶、郵寄進境的動物、

3、動物產(chǎn)品和其它檢疫物名錄、中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄等。第二節(jié) 動物檢疫的類型一、產(chǎn)地檢疫（quarantine in origin area）：指動物及動物產(chǎn)品在其生長或生產(chǎn)期間于原產(chǎn)地進行的檢疫。1. 收購檢疫：指養(yǎng)殖戶、農(nóng)牧埸以及規(guī)模養(yǎng)殖集團的動物、動物產(chǎn)品形成貿(mào)易規(guī)模時，由購銷單位和當(dāng)?shù)貦z疫部門配合進行的檢疫檢查。2. 屠宰檢疫：指對動物在屠宰前后進行的檢疫檢驗。一般分為宰前檢疫和宰后檢疫兩類。3. 市場檢疫：指對集貿(mào)市場交易、出售的動物和動物產(chǎn)品進行檢疫檢查。二、運輸檢疫（transport quarantine）：指動物和動物產(chǎn)品等檢疫物起運前由相關(guān)檢疫機構(gòu)

4、進行的檢疫檢查。1. 托運檢疫：指檢疫部門對托運的動物和動物產(chǎn)品等檢疫物進行的檢疫檢查2. 交通要道檢疫：指在交通要塞和起運頻繁的車站、碼頭、港口等地段設(shè)立檢疫消毒站，對運輸?shù)膭游?、動物產(chǎn)品進行檢疫，并查驗有關(guān)檢疫單證。對檢疫不合格的動物和動物產(chǎn)品等，就地依法進行檢疫處理。三、隔離檢疫（isolation quarantine）：指將輸入或輸出的動物在檢疫機關(guān)指定的隔離場所內(nèi)，于隔離條件下進行飼養(yǎng)，并在一定的觀察期內(nèi)進行疫病檢查、檢測和處理的檢疫措施。1. 隔離檢疫場：一般分國家級隔離檢疫場所和地方隔離檢疫場所。國家級隔離檢疫場所通常由國家進出境動物檢疫機關(guān)設(shè)立，主要針對國境檢疫中高風(fēng)險及中風(fēng)

5、險的動物疫病。2. 地方級隔離檢疫場：所通常由地方檢疫部門或貨主設(shè)立，主要針對國內(nèi)檢疫中的動物。進境動物的隔離檢疫時間依動物種類而定，一般進境的大中家畜和野生偶蹄類動物需45天，進境小動物或其它動物需30天。四、國境檢疫（territory quarantine）：又稱進出境檢疫或口岸檢疫，是由國家檢疫機構(gòu)對進出國境的動物、動物產(chǎn)品進行的檢疫。1、進境檢疫：包括進境動物檢疫和進境動物產(chǎn)品檢疫。是對動物、動物遺傳物質(zhì)和其他生物資源進行的檢疫。3、過境檢疫：過境檢疫是指由輸出國運輸至輸入國的動物、動物產(chǎn)品等檢疫物途經(jīng)第三國時，第三國口岸檢疫機構(gòu)對運輸動物、動物產(chǎn)品和運載工具等實施的動物檢疫。2、出

6、境檢疫：出境檢疫包括出境動物檢疫和出境動物產(chǎn)品檢疫。出境動物檢疫是指對輸出到其他國家和地區(qū)的種用、肉用或演藝用等飼養(yǎng)或野生的活動物出境前實施疫。五、檢疫監(jiān)管（quarantine supervision）：是檢驗檢疫監(jiān)督管理的簡稱，是指檢疫機關(guān)對輸入、輸出的動物、動物產(chǎn)品的養(yǎng)殖、生產(chǎn)、加工、存放、轉(zhuǎn)運等過程實施監(jiān)督管理的檢疫措施。（一）檢疫監(jiān)管的內(nèi)容1、進出境動物的檢疫許可、檢疫申報、產(chǎn)地檢疫、運輸檢疫和隔離檢疫監(jiān)管。2、批準(zhǔn)引進的禁止進境檢疫物的運輸、使用、存放等過程監(jiān)管。3、進出境肉類制品、腸衣、奶制品的加工、存放、轉(zhuǎn)運等過程監(jiān)管。4、進出境生皮張、生毛類等產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工、運輸?shù)冗^程監(jiān)管

7、。5、國際展覽會或博覽會期間，參展的動物和動物產(chǎn)品等檢疫物的檢疫監(jiān)管。6、過境活動物的檢疫許可、檢疫申報、運輸過程等檢疫監(jiān)管。（二）檢疫監(jiān)管的主要措施1、實行注冊登記制度 2、實行動物檢疫過程監(jiān)管3、建立檢疫監(jiān)管庫區(qū) 4、進行防疫檢疫培訓(xùn) 5、進行疫情監(jiān)測 六、電子檢疫監(jiān)管：是運用現(xiàn)代質(zhì)量管理理論和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)，借助公共網(wǎng)絡(luò)資源，通過數(shù)據(jù)資料和視頻信息的實時監(jiān)控，實現(xiàn)動物和動物產(chǎn)品從生產(chǎn)過程到銷售利用等環(huán)節(jié)中檢疫申報、風(fēng)險分析、過程監(jiān)督、項目檢測、符合驗證和檢疫放行等監(jiān)督管理的電子信息化系統(tǒng)。第三節(jié) 動物檢疫的風(fēng)險分析一、檢疫風(fēng)險（quarantine risk）：指動物疫病病原體、有毒有害物

8、質(zhì)隨動物、動物產(chǎn)品等檢疫物由輸出地傳入輸入地的可能性及其對輸入地生產(chǎn)、環(huán)境和公共衛(wèi)生造成的潛在危害。二、風(fēng)險分析（risk analysis）將風(fēng)險識別、風(fēng)險評估、風(fēng)險管理和風(fēng)險交流的一系列活動。三、風(fēng)險分析的步驟1. 風(fēng)險識別：指確定進境動物、動物產(chǎn)品等可能傳入病原體及有毒有害物質(zhì)的過程。在貿(mào)易流通過程中影響疫病傳播、流行的因素主要：（1）疫病因素（2）動物防疫體系：主要由獸醫(yī)機構(gòu)及人員、動物防疫檢疫立法、動物疫病控制計劃和動物防疫措施的實施及監(jiān)督等構(gòu)成。 （3）區(qū)域及地區(qū)劃分區(qū)域劃分：在一個國家，為了控制某種重大動物疫病，對于發(fā)生疫病的地區(qū)及其周圍不同距離的地區(qū)劃分成不同的區(qū)域?qū)嵤┓诸惞芾?/p>

9、，稱為區(qū)域劃分（zoning）。一般以疫病所在地為中心向外劃分為 5個區(qū)域，從外向內(nèi)依次為不使用疫苗接種的非疫區(qū)、不使用疫苗的監(jiān)測區(qū)、接種疫苗的非疫區(qū)、受威脅區(qū)、疫區(qū)。地區(qū)劃分：有相同或相近的動物衛(wèi)生狀況和疫病控制措施的鄰近國家或幾個國家或其部分地區(qū)在某種疫病防疫上可以作為一個地區(qū)來對待。2、風(fēng)險評估是對風(fēng)險因素及其發(fā)生的概率、危害的客觀估計。分為：A定性風(fēng)險評估：指用如高、中、低或極低等定性術(shù)語表示風(fēng)險發(fā)生的可能性或帶來后果的嚴(yán)重性的方式。B定量風(fēng)險評估是指用數(shù)據(jù)或概率等定量術(shù)語表示風(fēng)險分析結(jié)果的方式。（1）風(fēng)險評估的原則主要有：信息和資料應(yīng)體現(xiàn)科學(xué)性、完整性和可靠性。定性分析和定量風(fēng)險應(yīng)有

10、機結(jié)合。評估過程應(yīng)體現(xiàn)公正性、透明性和一致性，保證公平、合理并易為有關(guān)各方理解、認同。明確不確定事項、假設(shè)及其對最后評估結(jié)果的影響。（2）風(fēng)險評估的過程 釋放評估（release assessment）：揭示引入某種動物和動物產(chǎn)品等檢疫物向某一特殊環(huán)境釋放危害（如病原體等）的風(fēng)險，評價相關(guān)的生物學(xué)因素、防疫體系因素和貿(mào)易流通因素對釋放的影響，定性分析釋放事件發(fā)生的可能性，定量計算釋放事件發(fā)生的概率。暴露評估（exposure assessment）：闡明輸入地或進口國的人和動物暴露或接觸風(fēng)險源釋放危害（如病原體等）的風(fēng)險，評價相關(guān)的生物學(xué)因素、暴露因素、環(huán)境氣候因素、人文習(xí)俗因素和貿(mào)易流通因素

11、對暴露或接觸的影響，定性分析暴露或接觸事件發(fā)生的可能性，定量計算暴露或接觸事件發(fā)生的概率。后果評估（consequence assessment）：確定輸入地或進口國的人和動物暴露或接觸風(fēng)險源釋放的危害（如病原體等）所引起的潛在后果，定性分析引發(fā)潛在后果的可能性，定量計算引發(fā)潛在后果的概率。動物檢疫實踐中，風(fēng)險源釋放危害（如病原體等）所引發(fā)的后果一般分為直接后果和間接后果兩類。風(fēng)險計算（risk estimation）：對釋放評估、暴露評估和后果評估的風(fēng)險結(jié)果進行評定。3、風(fēng)險管理：指對引進某種動物及動物產(chǎn)品等檢疫物的風(fēng)險得出結(jié)論、制定防范風(fēng)險的決策并實施減少或避免風(fēng)險措施的過程。風(fēng)險管理由風(fēng)

12、險評價、方法評價、實施、監(jiān)管及審查等過程組成。4、風(fēng)險交流：指風(fēng)險管理者、風(fēng)險評估者及社會相關(guān)團體、公眾之間對風(fēng)險識別、評估、管理等方面的信息進行交流的過程。第四節(jié) 動物檢疫的基本程序 動物檢疫程序（quarantine procedure）一般包括檢疫審批、檢疫申報、檢疫實施、檢疫處理以及檢疫放行等5個環(huán)節(jié)。一、檢疫審批（quarantine permit）又稱檢疫許可，是在引進動物、動物產(chǎn)品、種質(zhì)材料等檢疫物時，引進單位或個人向檢疫機關(guān)提前提出申請，檢疫機關(guān)審查并決定是否批準(zhǔn)引進的檢疫程序。1、意義 ：（1）避免盲目引進，減少經(jīng)濟損失 （2）提出檢疫要求，預(yù)防疫病傳入 （3）簽訂貿(mào)易合同，

13、依法進行索賠2、類型：依據(jù)檢疫許可物的范圍，分為一般審批和特殊審批。在特殊審批中，檢疫許可物主要包括以下4類：（1）動物病原體（包括蟲種、菌種和毒種等）、害蟲及其他有害生物。（2）某種動物疫病流行的國家或地區(qū)的相關(guān)動物、動物產(chǎn)品、動物種質(zhì)材料等檢疫物。（3）動物尸體、動物標(biāo)本等。 （4）土壤。3、檢疫許可的基本手續(xù)（1）領(lǐng)取單證 （2）報請批準(zhǔn) （3）批準(zhǔn)發(fā)證二、檢疫申報：簡稱報檢，是檢疫物輸入或輸出時由貨主或代理人向檢疫機關(guān)及時聲明并申請檢疫的檢疫程序。在進出境動物檢疫中，下述4類檢疫物需進行檢疫申報：輸入、輸出的動物、動物產(chǎn)品及其他檢疫物。承運動物、動物產(chǎn)品及其他檢疫物的裝載容器、包裝物。

14、來自流行某種疫病疫區(qū)的運輸工具。過境的動物、動物產(chǎn)品及其他檢疫物。1、報檢機關(guān)：各口岸出入境檢驗檢疫局和各地區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)。2、檢疫申報的基本手續(xù)：報檢員首先填寫報檢單然后將報檢單、檢疫證書（由輸出國家或地區(qū)的官方檢疫機關(guān)出具）、產(chǎn)地證書、貿(mào)易合同、信用證、發(fā)票等單證一并交檢疫機關(guān)審驗。某些檢疫物需要提前進行檢疫申報。種用大動物及其精液、胚胎需提前30天報檢，小動物等需提前15天報檢。三、檢疫實施（一）現(xiàn)場檢疫：是檢疫人員在現(xiàn)場環(huán)境中對輸入或輸出的檢疫物進行查驗、檢查和抽樣，并初步確認是否符合相關(guān)檢疫要求的檢疫程序。（二）實驗室檢驗：是指借助實驗室儀器設(shè)備，利用一定檢測方法對現(xiàn)場抽取的檢疫

15、物樣品進行動物疫病病原體等有害生物檢查、鑒定和證實其存在的檢疫程序。（三）隔離檢疫四、檢疫處理：是檢疫機關(guān)依據(jù)檢疫法規(guī)和檢疫要求，根據(jù)現(xiàn)場檢疫和實驗室檢驗的結(jié)果，對檢疫物實施退回、銷毀或無害化處理的檢疫程序。1、檢疫處理的方式： 檢疫處理的方式包括消毒、退回、封存、撲殺、銷毀、除害處理、不準(zhǔn)入境、不準(zhǔn)出境和不準(zhǔn)過境等。2、無害化處理：簡稱除害處理，是指用物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等方法處理攜帶或疑似攜帶病原體的動物尸體、動物產(chǎn)品等檢疫物，以達到消滅傳染源、切斷傳染途徑、破壞毒素和消除有害物質(zhì)的檢疫措施。五、檢疫放行：是檢疫機關(guān)根據(jù)檢疫結(jié)果或無害化處理的程度，認為檢疫合格后，簽發(fā)檢疫證書、消毒證書、檢

16、疫放行單等相關(guān)單證并準(zhǔn)予出境、入境或過境的檢疫程序。第五節(jié) 動物檢疫檢驗樣品一、檢疫檢驗樣品的定義取自動物、動物產(chǎn)品等檢疫物或環(huán)境，擬通過檢驗檢查反映動物個體、群體、動物產(chǎn)品等檢疫物或環(huán)境有關(guān)檢疫狀況的材料或物品稱為檢疫檢驗樣品。二、檢疫檢驗樣品的種類1、動物組織樣品：心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、淋巴結(jié)、皮膚、血液等。2、動物廢棄物樣品：包括動物的各種排泄物、分泌物和滲出物。3、生殖系統(tǒng)樣品：主要包括動物死胎、流產(chǎn)胎兒、胎盤、陰道分泌物。4、動物種質(zhì)材料：主要指動物精液和胚胎。5、動物產(chǎn)品樣品：主要包括胴體、食用內(nèi)臟、食用骨血、原毛、皮張、骨頭、蹄角等。6、其他檢疫物樣品：主要包括動物飼料、空

17、氣、土壤、水源、墊料、媒介昆蟲等。三、樣品采集的一般原則1、及時采樣：采集病原分離的樣品時，須在病初發(fā)熱期或癥狀典型時采集。一般采集未經(jīng)治療動物的樣品；對瀕死期動物，可撲殺采樣；患傳染性疾病死亡的動物，盡可能立即采樣（一般在6小時以內(nèi)）。 2、合理采樣：不同疫病的需檢樣品各異，尚不能確定為何種疫病時，則應(yīng)全面采樣。3、典型采樣：采樣時，盡可能選取癥狀典型的病例和病變明顯的組織器官。 4、無菌采樣：避免環(huán)境中的微生物污染樣品，同時防止樣品中的病原體逸撒至周圍環(huán)境。5、適量采樣：采集樣品的量要滿足檢疫檢驗的需要，留足復(fù)檢時使用的樣品。6、安全采樣：采樣過程中，一要做好采樣人員的安全防護；二要防止造

18、成病原體污染環(huán)境或逸撒擴散，以防止疫病的傳播和蔓延。7、正確盛樣：采集時應(yīng)一種樣品一個容器，容器須完整無損，密封且不滲漏液體。8、迅速送樣：微生物檢查的樣品要求在冷藏條件24小時內(nèi)送達實驗室；病毒學(xué)檢驗的冷藏處理樣品，應(yīng)盡可能在數(shù)小時內(nèi)送達實驗室。經(jīng)凍結(jié)的樣品須在24小時內(nèi)送到。四、樣品采集及注意事項1、血液樣品：血液樣品應(yīng)在動物病畜體溫升高或發(fā)病期及未經(jīng)藥物治療期間采集。一般用滅菌注射器和真空采血管采集血樣。2、皮膚樣品：可用滅菌的器械取病變部位及與之交界的小部分“健康”皮膚；活動物的病變皮膚如水泡皮、結(jié)節(jié)、癡皮等可直接剪取或刮取。3、排泄物、分泌物和滲出物：眼、口腔、鼻腔、陰道分泌物或滲出

19、液，以滅菌棉拭子蘸??；咽喉食道分泌物，可用食道探子從已擴張的口腔伸入咽喉、食道處反復(fù)刮取；皮下水腫液和關(guān)節(jié)囊（腔）滲出液，用注射器從積液處抽?。恍厍?、腹腔滲出液，可在相應(yīng)部位刺入抽?。蛔鞑≡鷻z驗的膿汁應(yīng)在藥物治療之前采集。4、其他組織樣品第二章動物臨床檢疫第一節(jié) 臨床檢疫方法和設(shè)備一、臨床檢疫步驟：先進行大群檢疫從大群動物中檢出患病動物或可疑動物，進行個體檢疫。二、臨床檢疫的方法：“看、聽、摸、檢”三、臨床檢疫的三大環(huán)節(jié)1、運動時的檢查 2、休息時的檢查 3、攝食飲水檢查 四、臨床檢疫設(shè)備1、豬群檢疫設(shè)備：測溫小圈、測溫擋板、測溫夾道 2、牛群檢疫設(shè)備：排隊保定設(shè)備、檢疫夾道 3、羊群檢疫設(shè)

20、備：檢疫夾道4、家禽檢疫設(shè)備：檢疫飛溝、檢疫障板 第二節(jié) 豬臨床檢疫一、豬大群檢疫：1、運動狀態(tài)檢查2、休息時的檢查 3、攝食飲水檢查 二、豬的檢溫：正常體溫3839.5 三、豬個體檢疫：著眼點為精神外貌、姿態(tài)步樣、眼、鼻、口腔及咽喉、被毛及皮膚、肛門及排泄物、攝食及飲水以及體溫的變化等。第三節(jié)牛臨床檢疫一、牛大群檢疫：觀查牛的鼻鏡、鼻孔、嘴角、眼、呼吸及反芻情況二、牛的檢溫：正常體溫37.539.5 三、牛的個體檢查：精神外貌、姿態(tài)步樣、被毛皮膚、可視粘膜、口鼻體溫四、羊的檢溫：正常體溫38.540.5第四節(jié) 家禽臨床檢疫看嗉囊有無異常，雞的正常體溫4042.5，鴨4143，鵝40.542第

21、三章 病理學(xué)檢疫方法第一節(jié) 動物尸體剖檢概述病理學(xué)檢疫通常分為動物尸體剖檢檢查和病理組織學(xué)檢查。一、尸體變化1、尸冷：是指動物死亡后，尸體溫度逐漸降低至環(huán)境溫度的現(xiàn)象。2、尸僵：動物死亡后，最初由于神經(jīng)麻痹，肌肉失去緊張力而變松弛柔軟，但經(jīng)過很短時間后，肢體的肌肉即行收縮變?yōu)榻┯?，四肢各關(guān)節(jié)不能伸屈，使尸體固定于一定的形狀。3、尸斑：動物死亡后，由于心臟和大動脈管的臨終收縮及尸僵的發(fā)生，將血液排擠到靜脈系統(tǒng)內(nèi)，并由于重力作用，血液流向尸體的低下部位，使該部血管充盈血液。4、血液凝固：動物死后不久，在心臟和大血管內(nèi)的血液即凝固成塊，由于敗血病、窒息及一氧化碳中毒等死亡的動物，往往血液凝固不良。5

22、、尸體自溶與尸體腐?。?）尸體自溶：是指體內(nèi)組織受到酶（細胞本身的溶酶體酶、胃液、胰液中的蛋白分解酶等）的作用而引起的自體消化過程。自溶表現(xiàn)最明顯的是胃和胰腺。（2）尸體腐?。菏侵甘w組織蛋白由于細菌作用而發(fā)生腐敗分解現(xiàn)象。在腐敗過程中，并產(chǎn)生大量氣體，如氨、二氧化碳、甲烷、氮、硫化氫等。尸體腐敗可表現(xiàn)以下幾個方面的變化：1) 死后臌氣：胃腸道表現(xiàn)明顯。2) 肝、腎、脾等內(nèi)臟的腐敗：表現(xiàn)為肝臟體積增大，質(zhì)地變軟，色澤污灰，肝包膜下可見 到小氣泡，切面呈海綿狀，從切面可擠出混有泡沫的血水，這種變化稱為泡沫肝。3) 尸綠：出現(xiàn)是由于組織分解產(chǎn)生的硫化氫與紅細胞分解產(chǎn)生的血紅蛋白和鐵相結(jié)合，形 成硫

23、化血紅蛋白和硫化鐵，致使腐敗組織呈污綠色，這種變化在腸道表現(xiàn)得最為明顯。4) 尸臭：尸體腐敗過程中產(chǎn)生大量帶惡臭的氣體，如硫化氫、乙硫醇、甲硫醇、氨等，致 使腐敗的尸體具有特殊的惡臭氣味。二、尸體剖檢注意事項尸體剖檢前，應(yīng)先了解動物所在地區(qū)疾病的流行情況、生前病史、飼養(yǎng)管理等，仔細檢查尸體體表特征，如果發(fā)現(xiàn)可疑炭疽病例時，應(yīng)先采取尸體末梢血液作涂片染色檢查，在豬，則作下頜淋巴結(jié)涂片染色檢查，確診炭疽時，應(yīng)禁止剖檢，同時應(yīng)將尸體和被污染的場地、器具等進行嚴(yán)格消毒和處理。1、剖檢人員的防護：如血液或其他滲出物濺入眼內(nèi)，可用硼酸水充分沖洗。 2、尸體消毒和處理：2米坑掩埋，上覆生石灰和漂白粉。3、尸

24、體剖檢記錄：專門一位負責(zé)詳細記錄。三、病理材料的采取和寄送1、病原學(xué)檢驗材料采取和寄送：在采取病料前，先將尸體體表用2%臭藥水或2%來蘇兒消毒，再剖開體腔，以無菌操作采取所需要組織，放在預(yù)先滅菌的容器內(nèi)。2、血清學(xué)檢驗材料的采取和寄送：采取靜脈或心臟血，凝固后血清檢測抗體。3、中毒材料的采取和專送：采集大量的血液和較多的胃、腸內(nèi)容物，收集膀胱內(nèi)尿液，可疑的飼料，大塊肝臟和胃等組織，分別裝入清潔的容器內(nèi)送出。4、病理組織學(xué)檢驗材料的采取和寄送：根據(jù)剖檢所見和疑患疾病等具體情況，有重點地選取一些組織。所用刀剪要銳利，切割組織必須迅速而準(zhǔn)確。選取的組織應(yīng)具代表性，應(yīng)包括病變部和相鄰部位的組織，同時也

25、應(yīng)包括器官的重要結(jié)構(gòu)部分。第二節(jié) 大體標(biāo)本的制作和保存一、取材所選材料應(yīng)力求新鮮，要有代表性，既有病變部分，也有供對照的較為正常的部分。標(biāo)本厚度以 23 cm為宜，否則固定液難于滲透。較大器官可切取一部分固定。注意要暴露的某一切面應(yīng)首先切好，一般在固定后不再作切面。二、固定常用的固定液為10%福爾馬林。固定液的用量應(yīng)為標(biāo)本體積的510倍以上，較大標(biāo)本還應(yīng)在固定過程中更換固定液12次，固定時間約為2428小時。三、保存固定完全的病理標(biāo)本，取出在流水中充分沖洗后，即可裝于盛有足量10%福爾馬林溶液的標(biāo)本缸內(nèi)，用封瓶膠封口，貼上標(biāo)簽。原色標(biāo)本保存方法：用甲醛溶液保存的標(biāo)本，因組織內(nèi)的血紅蛋白被破壞溶

26、解，使原來色澤消失。如需制作原色標(biāo)本時，應(yīng)另選用固定液和保存液。方法：標(biāo)本固定在下列固定液內(nèi)，約310天（甲醛溶液（38%40% 100ml，硫酸鈉20g，蒸餾水1000ml）；取出標(biāo)本，流水沖洗224小時，用布吸干，移入80%95%酒精中，至原來顏色恢復(fù)后取出；保存于下列保存液內(nèi)（砒霜水溶液（2%）400ml，甘油600ml，砒霜溶解度在15時為1.66%，在25時為2%）。四、注意事項1、宜用新鮮標(biāo)本：最好采取不用水洗的新鮮標(biāo)本，以防紅細胞溶解失色。如標(biāo)本的液體過多，可用布吸干后，浸入固定液中固定。2、固定時間適中：固定時間應(yīng)視標(biāo)本大小及組織性質(zhì)而定。時間過短，組織得不到充分固定，以后放保

27、存液內(nèi)時，可發(fā)生渾濁，甚至失去防腐作用；時間過長，使組織增加酸性以后移入酒精中時，便不能轉(zhuǎn)化為變性的血紅蛋白，標(biāo)本就不可能恢復(fù)原色。3、經(jīng)固定的標(biāo)本應(yīng)沖洗干凈：在流水中充分沖洗至甲醛溶液氣味消失為止，用布吸干后，移入酒精中提煉，酒精可使甲醛溶液引起的酸性抗體變?yōu)閴A性抗體，后者顏色明顯且不易褪色。4、保持標(biāo)本原色不變 ：加蓋密封，防止陽光照射，第三節(jié) 病理切片技術(shù)從病料的采取到制成染色標(biāo)本，要經(jīng)過取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、染色和封固等步驟。一、取材 1、盡早固定：病理組織應(yīng)盡早固定，越新鮮越好，以免死后變化。2、取材部位：選擇正常組織與病灶交界處的組織。3、取材大?。呵腥〗M織塊的

28、大小為1.6×I.5×05cm，如做快速切片，則厚度不能超過0.2cm4、固定前的處理：組織塊固定時，不要彎曲扭轉(zhuǎn)，腸壁、胃壁、膽囊壁等，可先行平放在硬紙片上，然后慢慢放入固定液中。二、固定采取的病理材料必須立即放入固定液中。這樣細胞迅速死亡，能夠保持細胞原有的形狀和構(gòu)造組織所用的固定液不能太少，一般應(yīng)為組織塊體積的10倍，常用的固定液是95%酒精，10%中性甲醛（福爾馬林）溶液，還可用混合固定液，如酒精福爾馬林液、辛克氏液。三、脫水：組織經(jīng)固定和水洗后，組織中含有多量水分，必須先把組織內(nèi)的水分除去。脫水劑必須是與水在任何比率下均能混合的液體。脫水劑兼有硬化組織的作用。最常

29、用的脫水劑為酒精、丙酮等。1、酒精：脫水的程序為70%80%95%100%。各級酒精24小時，100%酒精有硬化組織的作用，脫水時間不宜太長，一般不超過3小時。2、丙酮：脫水力與收縮力比酒精強，為了避免組織過度收縮要先經(jīng)過低濃度丙酮（40%丙酮），再放入純丙酮中，每級浸1小時。四、透明：透明對組織有脫酒精及透明兩種作用，具有這種作用的試劑稱為透明劑。常用二甲苯、松油醇等。 五、透蠟：透蠟時間以能取代組織內(nèi)的全部透明劑，并充分滲入石蠟為原則。先將組織塊放入二甲苯加石蠟各半的混合液中，于5258溫箱內(nèi)放置1小時，然后將標(biāo)本移入保持在5258。溫箱中的石蠟23小時，或更長時間。一般的浸蠟時間為46小

30、時。如用松油醇、香柏油透明，則要延長透錯時間。六、包埋：將融解的石蠟倒入金屬包埋框中再將透過錯的組織塊放入包埋框的中央，并將預(yù)備切的組織面向下，等到石蠟表面形成薄膜時，立即將包理器沉入冷水內(nèi)1520min，取出石蠟塊按照組織塊大小劃分若干塊加以修整。七、切片：將蠟塊固定在石蠟切片機上，使蠟塊的切面與刀口成平行方向，刀的傾斜度通常為15度，轉(zhuǎn)動圓盤，調(diào)整切片厚度，切成46µm厚度的切片。持毛筆輕輕拔起切片，然后把切片放入3540的溫水皿中展平。切片移鋪在徐有蛋白甘油的載玻片上，進入烤片箱（4050，勿高于熔點），烘烤424時。八、染色1、染色前的推備工作：組織片經(jīng)二甲苯脫蠟1020mi

31、n，然后脫二甲苯從100%、95%、80%、70%、50%酒精各25min左右，然后水洗5min。2、對比染色法：蘇木素-伊紅染色法的染色順序：1) 切片經(jīng)脫蠟到水洗2) 移入Harris蘇木素液15min（淋巴組織染色時間要縮短），蘇木素主要染細胞核。3) 水洗4) 移入1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘至半分鐘（退去跑漿顏色，保存細胞核顏色，此種區(qū)別作 用稱為分化）。5) 中和，在加數(shù)滴飽和碳酸鋰溶液的水中處理半分鐘。6) 流水充分洗滌。7) 移入05%1%伊紅酒精溶液復(fù)染半分鐘（主要染細胞漿）。8) 脫水，95%和100%酒精各10min。9) 透明，二甲苯透明1015min。10) 封固，切片上滴

32、加中性加拿大樹膠，然后覆蓋上蓋玻片，干后即可應(yīng)用。第四章 免疫學(xué)檢疫方法 第一節(jié) 常規(guī)血清學(xué)試驗一、凝集試驗病原體顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體混合后，在適宜的電解質(zhì)環(huán)境下，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的凝集物，這種現(xiàn)象稱為凝集試驗。參于凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原。參與凝集反應(yīng)的抗體稱為凝集素。抗原抗體反應(yīng)時，按一定方法將抗原或抗體稀釋，出現(xiàn)明顯反應(yīng)終點的抗體或抗原的最高稀釋度稱為效價或滴度。（一）直接凝集試驗1、試管凝集試驗（一種定量實驗） 2、玻板凝集試驗（二）間接凝集試驗將可溶性抗原或抗體吸附于一定分子表面，吸附抗原或抗體的載體顆粒與相應(yīng)的抗體或抗原特異性結(jié)合，則可出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象

33、，稱為間接凝集反應(yīng)。間接凝集試驗依據(jù)使用載體的不同，一般分為間接血凝試驗、乳膠凝集試驗、炭凝集試驗等。1、間接血凝試驗：將紅細胞經(jīng)過鞣酸或其他偶聯(lián)劑處理，使多糖抗原、蛋白質(zhì)抗原或抗體被紅細胞表面的受體結(jié)合或吸附，這種被致敏的紅細胞與相應(yīng)的抗體或抗原特異性結(jié)合，可形成肉眼可見的紅細胞凝集現(xiàn)象。2、間接乳膠凝集試驗：以聚苯乙烯乳膠作為載體3、間接炭粉凝集試驗：用活性炭作為致敏載體（三）血凝試驗與凝集抑制試驗?zāi)承┎《净虿《狙?，可使某種或某幾種動物紅細胞發(fā)生凝集，病毒的這種特性稱為血凝性。這種凝集現(xiàn)象可被特異性病毒抗血清或抗體所抑制，稱為血凝抑制。二、沉淀試驗（一）環(huán)狀沉淀試驗在小口徑試管或發(fā)酵管

34、內(nèi)先加入已知抗血清，然后小心加入待檢抗原于血清表面，使兩種液體分界清楚。數(shù)分鐘，由于抗原和抗體發(fā)生結(jié)合，兩層液面交界處出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀。（二）絮狀沉淀試驗：一定電解質(zhì)環(huán)境下，抗原和相應(yīng)抗體以一定比例在試管內(nèi)或凹玻片內(nèi)混合，經(jīng)過一定時間，出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀或顆粒狀沉淀，絮狀沉淀試驗可用于毒素和抗毒素測定。（三）免疫擴散試驗1、單向單擴散：將抗血清加于溶化的瓊脂中，用毛細吸管分裝于內(nèi)徑3mm的小試管，凝固后在其上滴加待檢抗原，置密閉濕盒內(nèi)，恒溫下擴散。2、單向雙擴散：將含有抗體的瓊脂加于管底，中間加一層不含抗原同濃度的瓊脂，凝固后加待檢抗原。3、雙向單擴散：將抗血清入瓊脂中，澆成凝膠板，厚度2

35、3mm，在上面打孔，孔內(nèi)滴加抗原，抗原在孔內(nèi)向四周輻射擴散，與凝膠中的抗體結(jié)合形成白色沉淀環(huán)，換的大小與抗原濃度成正比。4、雙向雙擴散（常用）三、補體結(jié)合試驗（一）包括兩個系統(tǒng)：1、檢測系統(tǒng)：又稱為溶菌系統(tǒng)，由已知的抗原或抗體、待檢的抗體或抗原以及補體組成。豚鼠血液中補體含量高，故常用新鮮的豚鼠血清代替補體。2、指示系統(tǒng)：又稱溶血系統(tǒng)，由綿羊紅細胞和溶血素組成，溶血素系抗綿羊紅細胞的抗體。指示系統(tǒng)中綿羊紅細胞與溶血素特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，不僅可以結(jié)合補體，而且在結(jié)合補體后出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。如果發(fā)生溶血反應(yīng)，說明補體結(jié)合了綿羊紅細胞溶血素形成的抗原抗體復(fù)合物，證明檢測系統(tǒng)中抗原與抗體不存在特

36、異對應(yīng)關(guān)系。（二）補體結(jié)合試驗操作一般分預(yù)備試驗和正式試驗兩步進行1、預(yù)備試驗：包括溶血素效價測定，補體效價測定，抗原或抗體效價測定，以確定溶血素、補體、抗原或抗體的最適濃度和用量。2、正式試驗：將檢測系統(tǒng)之抗原或抗體、補體依次加入反應(yīng)管中，在一定溫度下感作一定時間后，加溶血素和紅細胞，再感作一定時間后，判定結(jié)果。第二節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)利用熒光素、酶和放射性元素等作為標(biāo)記物質(zhì)，標(biāo)記抗體或抗原分子用以示蹤抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，通過物理、化學(xué)等手段進行檢測，使不易觀察的抗原抗體反應(yīng)放大并轉(zhuǎn)化為可見的或可檢測的反應(yīng)，稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。分為免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)。一、免疫熒光技術(shù)也稱熒

37、光抗體技術(shù)，主要熒光色素有異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明和四甲基異硫氰酸羅丹明，標(biāo)記在抗體或抗原上，與相應(yīng)的抗原或抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光反應(yīng)。通過觀察標(biāo)記熒光素呈現(xiàn)的熒光反應(yīng)，檢測分析特異性抗原或抗體的存在。（一）基本方法1、直接熒光抗體技術(shù)：將標(biāo)記的特異熒光抗體直接滴加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時間的染色，洗滌除去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下檢查抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物發(fā)出的熒光。2、間接熒光抗體技術(shù)：用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，作用一定時間后，洗滌除去未反應(yīng)的抗體，再用熒光素標(biāo)記的抗抗體與抗原標(biāo)本反應(yīng)。3、補體熒光抗體

38、技術(shù)：將未標(biāo)記的抗體和補體加在抗原標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，洗滌，然后再加標(biāo)記的抗補體抗體。(二）檢測標(biāo)本制備鏡檢標(biāo)本的制備一般包括制片和固定兩大步驟。1、制片：（1）涂片和壓印片：涂片染色檢查是診斷工作中最常應(yīng)用的方法，適于感染動物的組織病料以及血液、膿、尿、糞便和穿刺液等。涂片方法按常規(guī)進行。壓印片是將被檢組織塊切開，以載玻片在切面上輕壓，使之粘上12層細胞。也可直接觸壓器官表面制片。自然干燥后進行固定。（2）冰凍切片和石蠟切片：冰凍切片：感染動物組織切成約3mm見方的小塊，置冷臺上，以6%明膠液作支持物，迅速冷凍至1520后切片，片厚48µm。（3）組織培養(yǎng)單層細胞：蓋玻片切成寬約

39、45mm的飛片，裝入小培養(yǎng)瓶內(nèi)，按常規(guī)方法培養(yǎng)各該病毒的敏感細胞。待細胞在飛片上長成單層時，即可接種病料，經(jīng)不同時間后取出被感染的細胞飛片。2、固定：用的固定液為丙酮二、免疫酶技術(shù)是將抗原抗體分子結(jié)合的特異性與酶促化學(xué)反應(yīng)的敏感性有機結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。常用的酶和底物：（1）辣根過氧化物酶：底物為過氧化氫（2）堿性磷酸酶：底物硝基苯磷酸鹽（一）免疫酶技術(shù)基本方法免疫酶技術(shù)在方法上分為兩類，一類用于組織細胞中的抗原或抗體成份檢出和定位，稱為免疫酶組織化學(xué)法或免疫酶染色法；另一種用于檢測液體中可溶性抗原或抗體成分，稱為免疫酶測定法。1、 免疫酶染色法：本方法與免疫熒光技術(shù)相同，只是以酶代

40、替熒光素作為標(biāo)記物，并以底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物為標(biāo)志。常規(guī)免疫酶染色法可分為直接和間接兩種方法。A、直接法：將被檢抗原吸附于固相載體（96孔聚苯乙烯反應(yīng)板），孵育后洗去未吸附的抗原，加入特異性的酶標(biāo)抗體，洗滌出去未反應(yīng)的物質(zhì)，加入底物，底物被分解出現(xiàn)顏色變化，顏色變化與抗原量呈正比。B、間接法：一般檢測抗體將一直抗原吸附于固相載體，孵育后洗去未吸附的抗原，隨后加入被檢血清，洗滌出去未反應(yīng)的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的抗抗體，反應(yīng)后再洗滌，再入底物，出現(xiàn)顏色變化，顏色變化的程度和速度與樣品中的抗體量呈正比。C、雙抗體夾心法：檢測抗原，將特異性免疫球蛋白吸附于固相載體表面，然后加入含有抗原的溶液洗除多余的抗原，再

41、加入酶標(biāo)記的特異性抗體，反應(yīng)后沖洗，加入酶底物，顏色改變與抗原量成正比。D、競爭法：測抗原將抗體吸附于固相載體表面，孵育后沖洗，加入待檢抗原樣品和酶標(biāo)記抗原，反應(yīng)后沖洗，加入酶的底物溶液，發(fā)生顏色變化。2、免疫酶測定法：免疫酶測定法分均相免疫酶測定法和固相免疫酶測定法兩類。固相免疫酶測定法以ELISA應(yīng)用最為廣泛。3、酶結(jié)合物的制備：有戊二醛法和過碘酸鈉法。三、放射免疫測定是將放射性同位素的高靈敏示蹤技術(shù)與抗原抗體特異性反應(yīng)有機結(jié)合用以測定介質(zhì)中微量活性物質(zhì)的一種檢測方法。常用的放射性同位素有3 H、125I、131I（一）放射免疫測定原理由標(biāo)記抗原（Ag*）與未標(biāo)記待檢抗原（Ag）競爭性地與

42、特異性抗體（Ab）相結(jié)合，當(dāng)反應(yīng)液中存在一定量的*Ag和Ab時，結(jié)合型*Ag-Ab（B）和游離型*Ag（F）的比例是一定的，保持著可逆的動態(tài)平衡。在該反應(yīng)系統(tǒng)中加入待檢的Ag，則Ag和*Ag競相與Ab結(jié)合，Ag的量越多，B/F值或B%越小。然后分別測定B和F的比放射性，即可計算出B/F值，用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)Ag和一定量的*Ag、Ab反應(yīng)，測出不同濃度Ag的B/F值或B%，以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度為橫座標(biāo)，B/F或B%為縱座標(biāo)即可繪成競爭性抑制反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同上法測出待檢抗原的B/F或B%，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其含量。第三節(jié) 變態(tài)反應(yīng)變態(tài)反應(yīng)（allergy）是指已免疫的動物機體在再次接觸同一種抗原物質(zhì)時

43、所發(fā)生的一種異常反應(yīng)，也叫超敏反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生包括致敏階段和反應(yīng)階段兩個過程。一般具有以下幾個特點：需有過敏原的刺激；過敏原高度特異性，兩次過敏原必須相同；需經(jīng)一定潛伏期，先使機體致敏，才能引起變態(tài)反應(yīng)；變態(tài)反應(yīng)的表現(xiàn)與反應(yīng)的程度既決定于抗原的質(zhì)和量，也決定于機體的反應(yīng)性差別。一、變應(yīng)原引起變態(tài)反應(yīng)的抗原稱為變應(yīng)原，變應(yīng)原種類很多，可以是完全抗原，如微生物、寄生蟲、昆蟲毒液、異種動物血清和組織提取物、疫苗、動物皮毛和飼料等；也可以是半抗原，如青霉素、磺胺類藥物、阿斯匹林等常用藥物和有機碘、汞劑等一些化學(xué)制劑，這些半抗原只有與蛋白質(zhì)結(jié)合后才表現(xiàn)變應(yīng)原性。二、變態(tài)反應(yīng)分類I型（過敏反應(yīng)）、型（

44、細胞毒型）、型（免疫復(fù)合物型）和型（遲發(fā)型）。前三型屬體液性變態(tài)反應(yīng)，其共同點是反應(yīng)發(fā)生較快，有的在數(shù)分鐘內(nèi)達到反應(yīng)高峰，常稱為速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。第型為細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，反應(yīng)發(fā)生緩慢，一般在648小時才達到反應(yīng)高峰，故稱為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。（一）I型變態(tài)反應(yīng)：出現(xiàn)迅速、反應(yīng)強烈。反應(yīng)可限于一種組織，也可波及全身。所表現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度差異較大，但很多時候是致命性的全身反應(yīng)。（二）型變態(tài)反應(yīng)：是抗體（1gG或IgM）與相應(yīng)的細胞或組織上的抗原結(jié)合，在補體、巨噬細胞和K細胞的參與下，造成細胞溶解、損傷，或被單核細胞所吞噬的反應(yīng)。臨診上許多免疫性血液病均屬此型。（三）型變態(tài)反應(yīng)：當(dāng)抗原進入已免疫的機體內(nèi)

45、，與抗體（1gG、IgM）在循環(huán)或體液中結(jié)合，形成中等大小的抗原-抗體復(fù)合物，若不能及時被清除，便沉積于局部毛細血管壁基底膜，激活補體、導(dǎo)致中性粒細胞聚集，引起血管炎癥，危害機體。因免疫復(fù)合物可經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)遍布全身，故常引起全身反應(yīng)。（四）IV型變態(tài)反應(yīng)：是機體再次接觸同種抗原許多小時后發(fā)生的一種以細胞免疫局部反應(yīng)為主的反應(yīng)。該型變態(tài)反應(yīng)是以淋巴細胞和巨噬細胞為主的滲出性炎癥反應(yīng)。三、動物疫病的變態(tài)反應(yīng)診斷 最常見：結(jié)核、馬鼻疽、布氏桿菌病 常用方法：皮內(nèi)反應(yīng)、點眼、皮下反應(yīng)第六章 病毒學(xué)檢疫技術(shù)第一節(jié) 病毒樣品的采集和預(yù)處理一、樣品的實驗室處理（一）組織器官樣品的處理敗涂地 （二）糞便樣品的處

46、理二、病毒的濃縮 對病毒含量很少的病毒樣品，必須經(jīng)過濃縮處理。1、聚乙二醇（PEG）濃縮 將分子量6000的PEG逐步加入經(jīng)一般處理的樣品溶液中，使終濃度為8%，置4過夜。3000×g離心15min，用少量含復(fù)合抗生素的PBS液重新懸浮。2、硫酸銨濃縮：將等量飽和硫酸銨溶液緩慢加入經(jīng)過上述一般處理的樣品溶液中，邊加邊攪拌，置過夜，離心同上。3、超濾器濃縮：可將250500ml的樣品濃縮至20ml左右。4、超速離心濃縮：將病毒樣品40000rpm離心60120min，絕大多數(shù)病毒將沉于管底。用少量PBS溶液懸浮病毒。僅適用于小體積的樣品。 第二節(jié) 病毒增殖、分離技術(shù)一、動物增殖、分離病

47、毒實驗動物病毒接種法：腦內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈、腹腔接種法 二、禽胚增殖分離病毒（1）羊膜腔接種：用于正粘病毒、副粘病毒的增殖和分離，初代分離時羊膜腔接種比尿囊腔接種敏感，用1112日齡。（2）絨毛尿囊膜接種：用于痘病毒、皰疹病毒的增殖和分離，取1012日齡禽胚。（3）尿囊腔接種：用于正粘病毒、副粘病毒的增殖和分離，取911日齡禽胚。（4）卵黃囊接種：用蟲媒披膜病毒、鸚鵡熱衣原體、立克次氏體的分離和增值。禽胚接種后，一般3739，孵化27天，每天照蛋12次，棄去接種后24小時死亡的雞胚，24小時后死亡的雞胚取出后4冷凍4小時收獲病毒。三、組織細胞增殖分離病毒細胞培養(yǎng)分為單層細胞培養(yǎng)和懸浮細胞培養(yǎng)

48、。單層細胞培養(yǎng)包括靜置培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使細胞在器皿的表面生長出單層或數(shù)層細胞。單層細胞常用來分離和繁殖病毒。懸浮細胞培養(yǎng)，是指細胞懸浮于營養(yǎng)液中繁殖的一種培養(yǎng)方法，它可進行連續(xù)培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)，常用來繁殖病毒生產(chǎn)疫苗。根據(jù)細胞株的不同，細胞培養(yǎng)又分為原代細胞培養(yǎng)、繼代細胞培養(yǎng)、二倍體細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)等。原代細胞培養(yǎng)是指直接從組織消化分散的細胞進行的第一代體外培養(yǎng)，繼代細胞培養(yǎng)是指將原代細胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來后再作培養(yǎng)，如果培養(yǎng)條件合適，細胞可連續(xù)傳代多次傳代細胞系也可通過來源于人和動物體的腫瘤組織獲得。由于遺傳突變或者在化學(xué)物質(zhì)以及致瘤病毒的作用之下，繼代培養(yǎng)細胞中有時出現(xiàn)惡性

49、變異細胞，此類細胞具有很高的生長和繁殖勢能，幾乎可以無限制地傳代，稱為傳代細胞，傳代細胞系也可通過來源于人和動物體的腫瘤組織獲得。（一）動物細胞培養(yǎng)方法1、原代細胞的培養(yǎng)（1）選擇910日齡雞胚（或1214日齡鴨胚），用70%75%酒精消毒胚蛋外殼。（2）從氣室端打開卵殼。取出雞胚，取頭、腳和內(nèi)臟，將軀干置于一滅菌小燒杯內(nèi)，用預(yù)冷的PBS溶液沖洗，用滅菌剪刀剪碎,加入PBS液沖洗組織碎塊，出去血液。（3）加入46倍體積的胰蛋白酶溶液，37消化1030分鐘，每隔10分鐘搖動一次。（4）去掉上清液，加入PBS洗滌2次。（5）去掉上清液，加細胞生長液制成10%的懸液，于4可保存34天；做細胞培養(yǎng)用，

50、則再作140的稀釋（終濃度1400），然后分裝到培養(yǎng)瓶中，于37培養(yǎng)48小時。2、繼代細胞的培養(yǎng)（1）侵出培養(yǎng)瓶中原有的細胞生長液，加入無鈣、鎂的PBS沖洗一次細胞表面。（2）加入胰蛋白酶溶液，室溫下不時搖動細胞瓶，直至細胞瓶發(fā)白、卷邊，即將脫落。（3）侵出消化液，輕拍輕拍細胞瓶，搖散細胞，再加入細胞液，并進一步搖散細胞。（4）根據(jù)細胞生長情況，分裝24個細胞瓶，培養(yǎng)于適宜溫度，應(yīng)于36小時長成單層。3、病毒接種（1）選擇新長滿的細胞單，棄掉舊的細胞生長液，每個細胞瓶，以浸沒細胞單層為宜。置37吸附60min。若樣品溶液很少以致不能浸沒細胞單層時，可將細胞瓶置于搖床上，緩慢搖動，使樣品不斷浸潤

51、全部細胞單層。（2）補加5倍或10倍于樣品溶液的細胞維持液于37培養(yǎng)。（3）每天觀察細胞病變（CPE），當(dāng)發(fā)生CPE時，做進一步鑒定。第三節(jié) 病毒鑒定一、理化特性鑒定氯仿敏感性試驗、酸敏感性試驗、熱敏感性試驗、陽離子穩(wěn)定性試驗 二、電子顯微鏡觀察（一）樣品制備1、糞便：用蒸餾水將糞便制成10%懸液，加入滅菌玻璃珠打勻，對半加入氟利昂混勻，以1000×g離心10min，取水相進行濃縮病毒。用幾滴蒸餾水重懸沉淀作為觀察樣品。2、病毒細胞培養(yǎng)物：當(dāng)細胞出現(xiàn)CPE時，凍融1-3次，以1000×g離心10min去渣，上清液按上文方法進行病毒濃縮，用幾滴蒸餾水重懸沉淀作為觀察樣品。3、

52、膿汁或C外樣品：將樣品在載玻片制成抹片自然干燥，以少量蒸餾水重新懸浮樣品材料。（二）負染技術(shù) 1、等量病毒懸液與2%的磷鎢酸染液混合。 2、滴加到有支持膜的金屬載網(wǎng)上。3、吸去過多的病毒然也混合物，電鏡下觀察。（三）免疫復(fù)合物的電鏡觀察1、選擇高滴度的病毒作為抗原，2、用等量經(jīng)適當(dāng)稀釋的抗血清對少量病毒進行處理，置于一密封容器中，37感作1小時3、加一滴每種方法處理的病毒樣品于載網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸鉀染色，電鏡觀察。4、通過觀察免疫血清與病毒粒子的特異性凝集而形成的大顆粒復(fù)合物以鑒定病毒。第七章 寄生蟲學(xué)檢疫技術(shù)第一節(jié) 糞便寄生蟲檢查一、糞便檢查基本方法（一）肉眼觀察：是檢查寄生蟲的基本方法。

53、寄生于動物消化道的絳蟲會不斷隨宿主糞便排出呈斷續(xù)面條狀（白色）的孕卵節(jié)片；其他一些消化道寄生蟲有時也可隨糞便排出體外。（二）涂片檢查：取50甘油水溶液或普通水12滴放于載玻片上，直接取黃豆大小的被檢糞便（塊）與之混勻，剔除粗糞渣，加蓋玻片，鏡檢蟲卵。但檢出率不高。（三）蟲卵漂浮法：主要用于檢查線蟲卵、絳蟲卵及球蟲卵囊等。取大約10g糞便弄碎，放于一容器內(nèi)，加入適量飽和鹽水?dāng)噭蜻^濾，靜置0.5h左右，用直徑0.51.0cm的金屬圈蘸取表面液膜，抖落于載玻片上，加蓋玻片后鏡檢；常用的漂浮液還有亞硫酸鈉飽和液、硫酸鎂飽和液、硝酸鈉飽和液、硝酸銨飽和液、硝酸鉛飽和液等。檢查相對密度較大的蟲卵，如棘頭蟲

54、蟲卵、豬肺絲蟲蟲卵及吸蟲卵時，需用硫酸鎂、硫代硫酸鈉以及硫酸鋅等飽和溶液。（四）蟲卵沉淀法：取一定量的糞便（大約5l0g）搗碎，放于一容器內(nèi)，加510倍量清水?dāng)噭?，?jīng)4060孔銅篩濾去大塊物質(zhì)后，讓其自然沉淀約20min，將上清液倒掉，再加入清水?dāng)噭?，再沉淀。如此反?fù)進行23次，至上清液清亮為止。最后傾倒掉大部分上清液，留約為沉淀物2倍的溶液量，用膠帽吸管吹吸均勻后，吸取少量于載玻片上，加蓋玻片鏡檢。使用離心沉淀法取代自然沉淀法，可以大大縮短沉淀的時間。（五）蟲卵計數(shù)法：常用的方法有麥克馬斯特氏法，計數(shù)時，取2g糞便弄碎，放入裝有玻璃珠的小瓶內(nèi)，加入飽和鹽水58ml充分震蕩混合，通過糞篩過濾。

55、然后將濾液邊搖晃邊用吸管吸取少量，加入計數(shù)室內(nèi)，放于顯微鏡載物臺上，靜置幾分鐘后，用低倍鏡將兩個計數(shù)室內(nèi)見到的蟲卵全部數(shù)完，取平均值乘以200，即為每克糞便中的蟲卵數(shù)。（六）幼蟲培養(yǎng)法：常用的方法是在培養(yǎng)皿底部加濾紙一張，而后將欲培養(yǎng)的糞便加水調(diào)成硬糊狀，塑成半球形，放于皿內(nèi)的紙上，并使半球形糞球的頂部略高出平皿邊沿，使加蓋時與皿蓋相接觸。將此皿置2530ºC溫箱（夏季放置室內(nèi)即可）中培養(yǎng)，注意保持皿內(nèi)濕度（應(yīng)使底部的墊紙保持潮濕狀態(tài)）。7l5d后，多數(shù)蟲卵即可發(fā)育成第三期幼蟲，并集中于皿蓋上的水滴中。將含有幼蟲的水滴吸出置載玻片上，用顯微鏡檢查。（七）幼蟲分離法：又稱貝爾曼氏法，用

56、一小段乳膠管兩端分別連接漏斗和小試管，然后置漏斗架上，通過漏斗加40溫水至漏斗中部，漏斗內(nèi)放置上有被檢材料（糞便或組織）的糞篩或紗布。靜置13h后，大部分幼蟲游走沉于試管底部。此時拿下小試管，吸棄上清液，取管底沉淀物鏡檢。也可將分離裝置放入溫箱內(nèi)過夜后檢查。也可用簡單平皿法分離幼蟲。取糞球若干個置于放有少量溫水（不超過40）的表面玻璃或平皿內(nèi)，經(jīng)10l5min后，取出糞球，吸取皿內(nèi)液體，在顯微鏡下檢查幼蟲。（八）毛蚴孵化法：取被檢糞便30100g（牛100g）經(jīng)沉淀集卵法處理后，將沉淀倒入500ml三角燒瓶內(nèi)。加溫清水（自來水需脫氯處理）至瓶口，置2226孵化。第1、3、5小時，用肉眼或放大鏡觀察并記錄一次。如見水面下有白色點狀物做直線來往運動，即是毛蚴，必要時吸出被檢液用顯微鏡觀察。第二節(jié) 組織寄生蟲檢查一、血液寄生蟲檢查（一）涂片鏡檢：一般在病畜體溫升高時采集耳靜脈血。用載玻片接觸最先流出的一滴血；或用注射器吸取血液滴于載玻片，制成血液涂片。干燥后用姬姆薩或瑞氏染色法染色鏡檢。（二）鮮血壓滴觀察：先將一滴生理鹽水置于載片上，然后滴上一滴被檢血液，充