動(dòng)物檢疫學(xué)講義課件

1、第一章 動(dòng)物檢疫學(xué)概論第一節(jié) 動(dòng)物檢疫概述一、動(dòng)物檢疫的定義動(dòng)物檢疫（quarantine）是遵照國(guó)家法律，運(yùn)用強(qiáng)制性手段和科學(xué)技術(shù)方法對(duì)動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品、運(yùn)載工具等進(jìn)行疫病方面的檢查，并采取相應(yīng)措施預(yù)防或阻斷動(dòng)物疾病的發(fā)生、流行以及從一個(gè)地區(qū)向另一個(gè)地區(qū)之間的傳播。三、動(dòng)物檢疫的意義和作用1.保護(hù)動(dòng)物生產(chǎn) 2.促進(jìn)經(jīng)濟(jì)貿(mào)易活動(dòng)的開(kāi)展 3.保護(hù)人類(lèi)健康 4.保障消費(fèi)者使用合格的動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品 四、動(dòng)物檢疫的基本屬性1.法制性 2.預(yù)防性 3.國(guó)際性 4.綜合性五、動(dòng)物檢疫的內(nèi)容 （一）檢疫性疫病動(dòng)物檢疫實(shí)質(zhì)是檢出引起動(dòng)物疾病特別是傳染病、寄生蟲(chóng)病的病原體以及其他有害生物。（二）檢疫物1、動(dòng)物、動(dòng)

2、物產(chǎn)品和其他檢疫物 2、運(yùn)載工具和器物其他檢疫物包括動(dòng)物血清、動(dòng)物廢棄物（分泌物、排泄物、滲出物以及脫落的皮屑、毛發(fā)等）、動(dòng)物疫苗、動(dòng)物飼料等。六、動(dòng)物檢疫法規(guī)（一）主要國(guó)際動(dòng)物檢疫相關(guān)組織及法規(guī)1、相關(guān)組織：有世界貿(mào)易組織（WTO）和國(guó)際獸疫局（OIE）。2、主要法規(guī)：與動(dòng)物檢疫相關(guān)的國(guó)際性法規(guī)主要有SPS協(xié)定和國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典。（二）中國(guó)有關(guān)動(dòng)物檢疫法規(guī)目前，主管我國(guó)動(dòng)物檢疫的國(guó)家機(jī)關(guān)是國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和農(nóng)業(yè)部，涉及我國(guó)動(dòng)物檢疫的主要法規(guī)包括中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法、中華人民共和國(guó)進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法、中華人民共和國(guó)進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法實(shí)施條例、中華人民共和國(guó)禁止攜帶、郵寄進(jìn)境的動(dòng)物、

3、動(dòng)物產(chǎn)品和其它檢疫物名錄、中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類(lèi)傳染病、寄生蟲(chóng)病名錄等。第二節(jié) 動(dòng)物檢疫的類(lèi)型一、產(chǎn)地檢疫（quarantine in origin area）：指動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品在其生長(zhǎng)或生產(chǎn)期間于原產(chǎn)地進(jìn)行的檢疫。1. 收購(gòu)檢疫：指養(yǎng)殖戶、農(nóng)牧埸以及規(guī)模養(yǎng)殖集團(tuán)的動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品形成貿(mào)易規(guī)模時(shí)，由購(gòu)銷(xiāo)單位和當(dāng)?shù)貦z疫部門(mén)配合進(jìn)行的檢疫檢查。2. 屠宰檢疫：指對(duì)動(dòng)物在屠宰前后進(jìn)行的檢疫檢驗(yàn)。一般分為宰前檢疫和宰后檢疫兩類(lèi)。3. 市場(chǎng)檢疫：指對(duì)集貿(mào)市場(chǎng)交易、出售的動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行檢疫檢查。二、運(yùn)輸檢疫（transport quarantine）：指動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物起運(yùn)前由相關(guān)檢疫機(jī)構(gòu)

4、進(jìn)行的檢疫檢查。1. 托運(yùn)檢疫：指檢疫部門(mén)對(duì)托運(yùn)的動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物進(jìn)行的檢疫檢查2. 交通要道檢疫：指在交通要塞和起運(yùn)頻繁的車(chē)站、碼頭、港口等地段設(shè)立檢疫消毒站，對(duì)運(yùn)輸?shù)膭?dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行檢疫，并查驗(yàn)有關(guān)檢疫單證。對(duì)檢疫不合格的動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品等，就地依法進(jìn)行檢疫處理。三、隔離檢疫（isolation quarantine）：指將輸入或輸出的動(dòng)物在檢疫機(jī)關(guān)指定的隔離場(chǎng)所內(nèi)，于隔離條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，并在一定的觀察期內(nèi)進(jìn)行疫病檢查、檢測(cè)和處理的檢疫措施。1. 隔離檢疫場(chǎng)：一般分國(guó)家級(jí)隔離檢疫場(chǎng)所和地方隔離檢疫場(chǎng)所。國(guó)家級(jí)隔離檢疫場(chǎng)所通常由國(guó)家進(jìn)出境動(dòng)物檢疫機(jī)關(guān)設(shè)立，主要針對(duì)國(guó)境檢疫中高風(fēng)險(xiǎn)及中風(fēng)

5、險(xiǎn)的動(dòng)物疫病。2. 地方級(jí)隔離檢疫場(chǎng)：所通常由地方檢疫部門(mén)或貨主設(shè)立，主要針對(duì)國(guó)內(nèi)檢疫中的動(dòng)物。進(jìn)境動(dòng)物的隔離檢疫時(shí)間依動(dòng)物種類(lèi)而定，一般進(jìn)境的大中家畜和野生偶蹄類(lèi)動(dòng)物需45天，進(jìn)境小動(dòng)物或其它動(dòng)物需30天。四、國(guó)境檢疫（territory quarantine）：又稱進(jìn)出境檢疫或口岸檢疫，是由國(guó)家檢疫機(jī)構(gòu)對(duì)進(jìn)出國(guó)境的動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行的檢疫。1、進(jìn)境檢疫：包括進(jìn)境動(dòng)物檢疫和進(jìn)境動(dòng)物產(chǎn)品檢疫。是對(duì)動(dòng)物、動(dòng)物遺傳物質(zhì)和其他生物資源進(jìn)行的檢疫。3、過(guò)境檢疫：過(guò)境檢疫是指由輸出國(guó)運(yùn)輸至輸入國(guó)的動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物途經(jīng)第三國(guó)時(shí)，第三國(guó)口岸檢疫機(jī)構(gòu)對(duì)運(yùn)輸動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品和運(yùn)載工具等實(shí)施的動(dòng)物檢疫。2、出

6、境檢疫：出境檢疫包括出境動(dòng)物檢疫和出境動(dòng)物產(chǎn)品檢疫。出境動(dòng)物檢疫是指對(duì)輸出到其他國(guó)家和地區(qū)的種用、肉用或演藝用等飼養(yǎng)或野生的活動(dòng)物出境前實(shí)施疫。五、檢疫監(jiān)管（quarantine supervision）：是檢驗(yàn)檢疫監(jiān)督管理的簡(jiǎn)稱，是指檢疫機(jī)關(guān)對(duì)輸入、輸出的動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品的養(yǎng)殖、生產(chǎn)、加工、存放、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程實(shí)施監(jiān)督管理的檢疫措施。（一）檢疫監(jiān)管的內(nèi)容1、進(jìn)出境動(dòng)物的檢疫許可、檢疫申報(bào)、產(chǎn)地檢疫、運(yùn)輸檢疫和隔離檢疫監(jiān)管。2、批準(zhǔn)引進(jìn)的禁止進(jìn)境檢疫物的運(yùn)輸、使用、存放等過(guò)程監(jiān)管。3、進(jìn)出境肉類(lèi)制品、腸衣、奶制品的加工、存放、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程監(jiān)管。4、進(jìn)出境生皮張、生毛類(lèi)等產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程監(jiān)管

7、。5、國(guó)際展覽會(huì)或博覽會(huì)期間，參展的動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物的檢疫監(jiān)管。6、過(guò)境活動(dòng)物的檢疫許可、檢疫申報(bào)、運(yùn)輸過(guò)程等檢疫監(jiān)管。（二）檢疫監(jiān)管的主要措施1、實(shí)行注冊(cè)登記制度 2、實(shí)行動(dòng)物檢疫過(guò)程監(jiān)管3、建立檢疫監(jiān)管庫(kù)區(qū) 4、進(jìn)行防疫檢疫培訓(xùn) 5、進(jìn)行疫情監(jiān)測(cè) 六、電子檢疫監(jiān)管：是運(yùn)用現(xiàn)代質(zhì)量管理理論和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)，借助公共網(wǎng)絡(luò)資源，通過(guò)數(shù)據(jù)資料和視頻信息的實(shí)時(shí)監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品從生產(chǎn)過(guò)程到銷(xiāo)售利用等環(huán)節(jié)中檢疫申報(bào)、風(fēng)險(xiǎn)分析、過(guò)程監(jiān)督、項(xiàng)目檢測(cè)、符合驗(yàn)證和檢疫放行等監(jiān)督管理的電子信息化系統(tǒng)。第三節(jié) 動(dòng)物檢疫的風(fēng)險(xiǎn)分析一、檢疫風(fēng)險(xiǎn)（quarantine risk）：指動(dòng)物疫病病原體、有毒有害物

8、質(zhì)隨動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物由輸出地傳入輸入地的可能性及其對(duì)輸入地生產(chǎn)、環(huán)境和公共衛(wèi)生造成的潛在危害。二、風(fēng)險(xiǎn)分析（risk analysis）將風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、風(fēng)險(xiǎn)管理和風(fēng)險(xiǎn)交流的一系列活動(dòng)。三、風(fēng)險(xiǎn)分析的步驟1. 風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別：指確定進(jìn)境動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品等可能傳入病原體及有毒有害物質(zhì)的過(guò)程。在貿(mào)易流通過(guò)程中影響疫病傳播、流行的因素主要：（1）疫病因素（2）動(dòng)物防疫體系：主要由獸醫(yī)機(jī)構(gòu)及人員、動(dòng)物防疫檢疫立法、動(dòng)物疫病控制計(jì)劃和動(dòng)物防疫措施的實(shí)施及監(jiān)督等構(gòu)成。 （3）區(qū)域及地區(qū)劃分區(qū)域劃分：在一個(gè)國(guó)家，為了控制某種重大動(dòng)物疫病，對(duì)于發(fā)生疫病的地區(qū)及其周?chē)煌嚯x的地區(qū)劃分成不同的區(qū)域?qū)嵤┓诸?lèi)管理

9、，稱為區(qū)域劃分（zoning）。一般以疫病所在地為中心向外劃分為 5個(gè)區(qū)域，從外向內(nèi)依次為不使用疫苗接種的非疫區(qū)、不使用疫苗的監(jiān)測(cè)區(qū)、接種疫苗的非疫區(qū)、受威脅區(qū)、疫區(qū)。地區(qū)劃分：有相同或相近的動(dòng)物衛(wèi)生狀況和疫病控制措施的鄰近國(guó)家或幾個(gè)國(guó)家或其部分地區(qū)在某種疫病防疫上可以作為一個(gè)地區(qū)來(lái)對(duì)待。2、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素及其發(fā)生的概率、危害的客觀估計(jì)。分為：A定性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：指用如高、中、低或極低等定性術(shù)語(yǔ)表示風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生的可能性或帶來(lái)后果的嚴(yán)重性的方式。B定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是指用數(shù)據(jù)或概率等定量術(shù)語(yǔ)表示風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果的方式。（1）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的原則主要有：信息和資料應(yīng)體現(xiàn)科學(xué)性、完整性和可靠性。定性分析和定量風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)有

10、機(jī)結(jié)合。評(píng)估過(guò)程應(yīng)體現(xiàn)公正性、透明性和一致性，保證公平、合理并易為有關(guān)各方理解、認(rèn)同。明確不確定事項(xiàng)、假設(shè)及其對(duì)最后評(píng)估結(jié)果的影響。（2）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的過(guò)程 釋放評(píng)估（release assessment）：揭示引入某種動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物向某一特殊環(huán)境釋放危害（如病原體等）的風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)價(jià)相關(guān)的生物學(xué)因素、防疫體系因素和貿(mào)易流通因素對(duì)釋放的影響，定性分析釋放事件發(fā)生的可能性，定量計(jì)算釋放事件發(fā)生的概率。暴露評(píng)估（exposure assessment）：闡明輸入地或進(jìn)口國(guó)的人和動(dòng)物暴露或接觸風(fēng)險(xiǎn)源釋放危害（如病原體等）的風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)價(jià)相關(guān)的生物學(xué)因素、暴露因素、環(huán)境氣候因素、人文習(xí)俗因素和貿(mào)易流通因素

11、對(duì)暴露或接觸的影響，定性分析暴露或接觸事件發(fā)生的可能性，定量計(jì)算暴露或接觸事件發(fā)生的概率。后果評(píng)估（consequence assessment）：確定輸入地或進(jìn)口國(guó)的人和動(dòng)物暴露或接觸風(fēng)險(xiǎn)源釋放的危害（如病原體等）所引起的潛在后果，定性分析引發(fā)潛在后果的可能性，定量計(jì)算引發(fā)潛在后果的概率。動(dòng)物檢疫實(shí)踐中，風(fēng)險(xiǎn)源釋放危害（如病原體等）所引發(fā)的后果一般分為直接后果和間接后果兩類(lèi)。風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算（risk estimation）：對(duì)釋放評(píng)估、暴露評(píng)估和后果評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。3、風(fēng)險(xiǎn)管理：指對(duì)引進(jìn)某種動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物的風(fēng)險(xiǎn)得出結(jié)論、制定防范風(fēng)險(xiǎn)的決策并實(shí)施減少或避免風(fēng)險(xiǎn)措施的過(guò)程。風(fēng)險(xiǎn)管理由風(fēng)

12、險(xiǎn)評(píng)價(jià)、方法評(píng)價(jià)、實(shí)施、監(jiān)管及審查等過(guò)程組成。4、風(fēng)險(xiǎn)交流：指風(fēng)險(xiǎn)管理者、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估者及社會(huì)相關(guān)團(tuán)體、公眾之間對(duì)風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別、評(píng)估、管理等方面的信息進(jìn)行交流的過(guò)程。第四節(jié) 動(dòng)物檢疫的基本程序 動(dòng)物檢疫程序（quarantine procedure）一般包括檢疫審批、檢疫申報(bào)、檢疫實(shí)施、檢疫處理以及檢疫放行等5個(gè)環(huán)節(jié)。一、檢疫審批（quarantine permit）又稱檢疫許可，是在引進(jìn)動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品、種質(zhì)材料等檢疫物時(shí)，引進(jìn)單位或個(gè)人向檢疫機(jī)關(guān)提前提出申請(qǐng)，檢疫機(jī)關(guān)審查并決定是否批準(zhǔn)引進(jìn)的檢疫程序。1、意義 ：（1）避免盲目引進(jìn)，減少經(jīng)濟(jì)損失 （2）提出檢疫要求，預(yù)防疫病傳入 （3）簽訂貿(mào)易合同，

13、依法進(jìn)行索賠2、類(lèi)型：依據(jù)檢疫許可物的范圍，分為一般審批和特殊審批。在特殊審批中，檢疫許可物主要包括以下4類(lèi)：（1）動(dòng)物病原體（包括蟲(chóng)種、菌種和毒種等）、害蟲(chóng)及其他有害生物。（2）某種動(dòng)物疫病流行的國(guó)家或地區(qū)的相關(guān)動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品、動(dòng)物種質(zhì)材料等檢疫物。（3）動(dòng)物尸體、動(dòng)物標(biāo)本等。 （4）土壤。3、檢疫許可的基本手續(xù)（1）領(lǐng)取單證 （2）報(bào)請(qǐng)批準(zhǔn) （3）批準(zhǔn)發(fā)證二、檢疫申報(bào)：簡(jiǎn)稱報(bào)檢，是檢疫物輸入或輸出時(shí)由貨主或代理人向檢疫機(jī)關(guān)及時(shí)聲明并申請(qǐng)檢疫的檢疫程序。在進(jìn)出境動(dòng)物檢疫中，下述4類(lèi)檢疫物需進(jìn)行檢疫申報(bào)：輸入、輸出的動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品及其他檢疫物。承運(yùn)動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品及其他檢疫物的裝載容器、包裝物。

14、來(lái)自流行某種疫病疫區(qū)的運(yùn)輸工具。過(guò)境的動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品及其他檢疫物。1、報(bào)檢機(jī)關(guān)：各口岸出入境檢驗(yàn)檢疫局和各地區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)。2、檢疫申報(bào)的基本手續(xù)：報(bào)檢員首先填寫(xiě)報(bào)檢單然后將報(bào)檢單、檢疫證書(shū)（由輸出國(guó)家或地區(qū)的官方檢疫機(jī)關(guān)出具）、產(chǎn)地證書(shū)、貿(mào)易合同、信用證、發(fā)票等單證一并交檢疫機(jī)關(guān)審驗(yàn)。某些檢疫物需要提前進(jìn)行檢疫申報(bào)。種用大動(dòng)物及其精液、胚胎需提前30天報(bào)檢，小動(dòng)物等需提前15天報(bào)檢。三、檢疫實(shí)施（一）現(xiàn)場(chǎng)檢疫：是檢疫人員在現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中對(duì)輸入或輸出的檢疫物進(jìn)行查驗(yàn)、檢查和抽樣，并初步確認(rèn)是否符合相關(guān)檢疫要求的檢疫程序。（二）實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)：是指借助實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，利用一定檢測(cè)方法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)抽取的檢疫

15、物樣品進(jìn)行動(dòng)物疫病病原體等有害生物檢查、鑒定和證實(shí)其存在的檢疫程序。（三）隔離檢疫四、檢疫處理：是檢疫機(jī)關(guān)依據(jù)檢疫法規(guī)和檢疫要求，根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)檢疫和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)檢疫物實(shí)施退回、銷(xiāo)毀或無(wú)害化處理的檢疫程序。1、檢疫處理的方式： 檢疫處理的方式包括消毒、退回、封存、撲殺、銷(xiāo)毀、除害處理、不準(zhǔn)入境、不準(zhǔn)出境和不準(zhǔn)過(guò)境等。2、無(wú)害化處理：簡(jiǎn)稱除害處理，是指用物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等方法處理攜帶或疑似攜帶病原體的動(dòng)物尸體、動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物，以達(dá)到消滅傳染源、切斷傳染途徑、破壞毒素和消除有害物質(zhì)的檢疫措施。五、檢疫放行：是檢疫機(jī)關(guān)根據(jù)檢疫結(jié)果或無(wú)害化處理的程度，認(rèn)為檢疫合格后，簽發(fā)檢疫證書(shū)、消毒證書(shū)、檢

16、疫放行單等相關(guān)單證并準(zhǔn)予出境、入境或過(guò)境的檢疫程序。第五節(jié) 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)樣品一、檢疫檢驗(yàn)樣品的定義取自動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物或環(huán)境，擬通過(guò)檢驗(yàn)檢查反映動(dòng)物個(gè)體、群體、動(dòng)物產(chǎn)品等檢疫物或環(huán)境有關(guān)檢疫狀況的材料或物品稱為檢疫檢驗(yàn)樣品。二、檢疫檢驗(yàn)樣品的種類(lèi)1、動(dòng)物組織樣品：心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、淋巴結(jié)、皮膚、血液等。2、動(dòng)物廢棄物樣品：包括動(dòng)物的各種排泄物、分泌物和滲出物。3、生殖系統(tǒng)樣品：主要包括動(dòng)物死胎、流產(chǎn)胎兒、胎盤(pán)、陰道分泌物。4、動(dòng)物種質(zhì)材料：主要指動(dòng)物精液和胚胎。5、動(dòng)物產(chǎn)品樣品：主要包括胴體、食用內(nèi)臟、食用骨血、原毛、皮張、骨頭、蹄角等。6、其他檢疫物樣品：主要包括動(dòng)物飼料、空

17、氣、土壤、水源、墊料、媒介昆蟲(chóng)等。三、樣品采集的一般原則1、及時(shí)采樣：采集病原分離的樣品時(shí)，須在病初發(fā)熱期或癥狀典型時(shí)采集。一般采集未經(jīng)治療動(dòng)物的樣品；對(duì)瀕死期動(dòng)物，可撲殺采樣；患傳染性疾病死亡的動(dòng)物，盡可能立即采樣（一般在6小時(shí)以內(nèi)）。 2、合理采樣：不同疫病的需檢樣品各異，尚不能確定為何種疫病時(shí)，則應(yīng)全面采樣。3、典型采樣：采樣時(shí)，盡可能選取癥狀典型的病例和病變明顯的組織器官。 4、無(wú)菌采樣：避免環(huán)境中的微生物污染樣品，同時(shí)防止樣品中的病原體逸撒至周?chē)h(huán)境。5、適量采樣：采集樣品的量要滿足檢疫檢驗(yàn)的需要，留足復(fù)檢時(shí)使用的樣品。6、安全采樣：采樣過(guò)程中，一要做好采樣人員的安全防護(hù)；二要防止造

18、成病原體污染環(huán)境或逸撒擴(kuò)散，以防止疫病的傳播和蔓延。7、正確盛樣：采集時(shí)應(yīng)一種樣品一個(gè)容器，容器須完整無(wú)損，密封且不滲漏液體。8、迅速送樣：微生物檢查的樣品要求在冷藏條件24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；病毒學(xué)檢驗(yàn)的冷藏處理樣品，應(yīng)盡可能在數(shù)小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)凍結(jié)的樣品須在24小時(shí)內(nèi)送到。四、樣品采集及注意事項(xiàng)1、血液樣品：血液樣品應(yīng)在動(dòng)物病畜體溫升高或發(fā)病期及未經(jīng)藥物治療期間采集。一般用滅菌注射器和真空采血管采集血樣。2、皮膚樣品：可用滅菌的器械取病變部位及與之交界的小部分“健康”皮膚；活動(dòng)物的病變皮膚如水泡皮、結(jié)節(jié)、癡皮等可直接剪取或刮取。3、排泄物、分泌物和滲出物：眼、口腔、鼻腔、陰道分泌物或滲出

19、液，以滅菌棉拭子蘸??；咽喉食道分泌物，可用食道探子從已擴(kuò)張的口腔伸入咽喉、食道處反復(fù)刮取；皮下水腫液和關(guān)節(jié)囊（腔）滲出液，用注射器從積液處抽?。恍厍?、腹腔滲出液，可在相應(yīng)部位刺入抽?。蛔鞑≡鷻z驗(yàn)的膿汁應(yīng)在藥物治療之前采集。4、其他組織樣品第二章動(dòng)物臨床檢疫第一節(jié) 臨床檢疫方法和設(shè)備一、臨床檢疫步驟：先進(jìn)行大群檢疫從大群動(dòng)物中檢出患病動(dòng)物或可疑動(dòng)物，進(jìn)行個(gè)體檢疫。二、臨床檢疫的方法：“看、聽(tīng)、摸、檢”三、臨床檢疫的三大環(huán)節(jié)1、運(yùn)動(dòng)時(shí)的檢查 2、休息時(shí)的檢查 3、攝食飲水檢查 四、臨床檢疫設(shè)備1、豬群檢疫設(shè)備：測(cè)溫小圈、測(cè)溫?fù)醢?、測(cè)溫夾道 2、牛群檢疫設(shè)備：排隊(duì)保定設(shè)備、檢疫夾道 3、羊群檢疫設(shè)

20、備：檢疫夾道4、家禽檢疫設(shè)備：檢疫飛溝、檢疫障板 第二節(jié) 豬臨床檢疫一、豬大群檢疫：1、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)檢查2、休息時(shí)的檢查 3、攝食飲水檢查 二、豬的檢溫：正常體溫3839.5 三、豬個(gè)體檢疫：著眼點(diǎn)為精神外貌、姿態(tài)步樣、眼、鼻、口腔及咽喉、被毛及皮膚、肛門(mén)及排泄物、攝食及飲水以及體溫的變化等。第三節(jié)牛臨床檢疫一、牛大群檢疫：觀查牛的鼻鏡、鼻孔、嘴角、眼、呼吸及反芻情況二、牛的檢溫：正常體溫37.539.5 三、牛的個(gè)體檢查：精神外貌、姿態(tài)步樣、被毛皮膚、可視粘膜、口鼻體溫四、羊的檢溫：正常體溫38.540.5第四節(jié) 家禽臨床檢疫看嗉囊有無(wú)異常，雞的正常體溫4042.5，鴨4143，鵝40.542第

21、三章 病理學(xué)檢疫方法第一節(jié) 動(dòng)物尸體剖檢概述病理學(xué)檢疫通常分為動(dòng)物尸體剖檢檢查和病理組織學(xué)檢查。一、尸體變化1、尸冷：是指動(dòng)物死亡后，尸體溫度逐漸降低至環(huán)境溫度的現(xiàn)象。2、尸僵：動(dòng)物死亡后，最初由于神經(jīng)麻痹，肌肉失去緊張力而變松弛柔軟，但經(jīng)過(guò)很短時(shí)間后，肢體的肌肉即行收縮變?yōu)榻┯玻闹麝P(guān)節(jié)不能伸屈，使尸體固定于一定的形狀。3、尸斑：動(dòng)物死亡后，由于心臟和大動(dòng)脈管的臨終收縮及尸僵的發(fā)生，將血液排擠到靜脈系統(tǒng)內(nèi)，并由于重力作用，血液流向尸體的低下部位，使該部血管充盈血液。4、血液凝固：動(dòng)物死后不久，在心臟和大血管內(nèi)的血液即凝固成塊，由于敗血病、窒息及一氧化碳中毒等死亡的動(dòng)物，往往血液凝固不良。5

22、、尸體自溶與尸體腐敗（1）尸體自溶：是指體內(nèi)組織受到酶（細(xì)胞本身的溶酶體酶、胃液、胰液中的蛋白分解酶等）的作用而引起的自體消化過(guò)程。自溶表現(xiàn)最明顯的是胃和胰腺。（2）尸體腐?。菏侵甘w組織蛋白由于細(xì)菌作用而發(fā)生腐敗分解現(xiàn)象。在腐敗過(guò)程中，并產(chǎn)生大量氣體，如氨、二氧化碳、甲烷、氮、硫化氫等。尸體腐敗可表現(xiàn)以下幾個(gè)方面的變化：1) 死后臌氣：胃腸道表現(xiàn)明顯。2) 肝、腎、脾等內(nèi)臟的腐敗：表現(xiàn)為肝臟體積增大，質(zhì)地變軟，色澤污灰，肝包膜下可見(jiàn) 到小氣泡，切面呈海綿狀，從切面可擠出混有泡沫的血水，這種變化稱為泡沫肝。3) 尸綠：出現(xiàn)是由于組織分解產(chǎn)生的硫化氫與紅細(xì)胞分解產(chǎn)生的血紅蛋白和鐵相結(jié)合，形 成硫

23、化血紅蛋白和硫化鐵，致使腐敗組織呈污綠色，這種變化在腸道表現(xiàn)得最為明顯。4) 尸臭：尸體腐敗過(guò)程中產(chǎn)生大量帶惡臭的氣體，如硫化氫、乙硫醇、甲硫醇、氨等，致 使腐敗的尸體具有特殊的惡臭氣味。二、尸體剖檢注意事項(xiàng)尸體剖檢前，應(yīng)先了解動(dòng)物所在地區(qū)疾病的流行情況、生前病史、飼養(yǎng)管理等，仔細(xì)檢查尸體體表特征，如果發(fā)現(xiàn)可疑炭疽病例時(shí)，應(yīng)先采取尸體末梢血液作涂片染色檢查，在豬，則作下頜淋巴結(jié)涂片染色檢查，確診炭疽時(shí)，應(yīng)禁止剖檢，同時(shí)應(yīng)將尸體和被污染的場(chǎng)地、器具等進(jìn)行嚴(yán)格消毒和處理。1、剖檢人員的防護(hù)：如血液或其他滲出物濺入眼內(nèi)，可用硼酸水充分沖洗。 2、尸體消毒和處理：2米坑掩埋，上覆生石灰和漂白粉。3、尸

24、體剖檢記錄：專門(mén)一位負(fù)責(zé)詳細(xì)記錄。三、病理材料的采取和寄送1、病原學(xué)檢驗(yàn)材料采取和寄送：在采取病料前，先將尸體體表用2%臭藥水或2%來(lái)蘇兒消毒，再剖開(kāi)體腔，以無(wú)菌操作采取所需要組織，放在預(yù)先滅菌的容器內(nèi)。2、血清學(xué)檢驗(yàn)材料的采取和寄送：采取靜脈或心臟血，凝固后血清檢測(cè)抗體。3、中毒材料的采取和專送：采集大量的血液和較多的胃、腸內(nèi)容物，收集膀胱內(nèi)尿液，可疑的飼料，大塊肝臟和胃等組織，分別裝入清潔的容器內(nèi)送出。4、病理組織學(xué)檢驗(yàn)材料的采取和寄送：根據(jù)剖檢所見(jiàn)和疑患疾病等具體情況，有重點(diǎn)地選取一些組織。所用刀剪要銳利，切割組織必須迅速而準(zhǔn)確。選取的組織應(yīng)具代表性，應(yīng)包括病變部和相鄰部位的組織，同時(shí)也

25、應(yīng)包括器官的重要結(jié)構(gòu)部分。第二節(jié) 大體標(biāo)本的制作和保存一、取材所選材料應(yīng)力求新鮮，要有代表性，既有病變部分，也有供對(duì)照的較為正常的部分。標(biāo)本厚度以 23 cm為宜，否則固定液難于滲透。較大器官可切取一部分固定。注意要暴露的某一切面應(yīng)首先切好，一般在固定后不再作切面。二、固定常用的固定液為10%福爾馬林。固定液的用量應(yīng)為標(biāo)本體積的510倍以上，較大標(biāo)本還應(yīng)在固定過(guò)程中更換固定液12次，固定時(shí)間約為2428小時(shí)。三、保存固定完全的病理標(biāo)本，取出在流水中充分沖洗后，即可裝于盛有足量10%福爾馬林溶液的標(biāo)本缸內(nèi)，用封瓶膠封口，貼上標(biāo)簽。原色標(biāo)本保存方法：用甲醛溶液保存的標(biāo)本，因組織內(nèi)的血紅蛋白被破壞溶

26、解，使原來(lái)色澤消失。如需制作原色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)另選用固定液和保存液。方法：標(biāo)本固定在下列固定液內(nèi)，約310天（甲醛溶液（38%40% 100ml，硫酸鈉20g，蒸餾水1000ml）；取出標(biāo)本，流水沖洗224小時(shí)，用布吸干，移入80%95%酒精中，至原來(lái)顏色恢復(fù)后取出；保存于下列保存液內(nèi)（砒霜水溶液（2%）400ml，甘油600ml，砒霜溶解度在15時(shí)為1.66%，在25時(shí)為2%）。四、注意事項(xiàng)1、宜用新鮮標(biāo)本：最好采取不用水洗的新鮮標(biāo)本，以防紅細(xì)胞溶解失色。如標(biāo)本的液體過(guò)多，可用布吸干后，浸入固定液中固定。2、固定時(shí)間適中：固定時(shí)間應(yīng)視標(biāo)本大小及組織性質(zhì)而定。時(shí)間過(guò)短，組織得不到充分固定，以后放保

27、存液內(nèi)時(shí)，可發(fā)生渾濁，甚至失去防腐作用；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使組織增加酸性以后移入酒精中時(shí)，便不能轉(zhuǎn)化為變性的血紅蛋白，標(biāo)本就不可能恢復(fù)原色。3、經(jīng)固定的標(biāo)本應(yīng)沖洗干凈：在流水中充分沖洗至甲醛溶液氣味消失為止，用布吸干后，移入酒精中提煉，酒精可使甲醛溶液引起的酸性抗體變?yōu)閴A性抗體，后者顏色明顯且不易褪色。4、保持標(biāo)本原色不變 ：加蓋密封，防止陽(yáng)光照射，第三節(jié) 病理切片技術(shù)從病料的采取到制成染色標(biāo)本，要經(jīng)過(guò)取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、染色和封固等步驟。一、取材 1、盡早固定：病理組織應(yīng)盡早固定，越新鮮越好，以免死后變化。2、取材部位：選擇正常組織與病灶交界處的組織。3、取材大?。呵腥〗M織塊的

28、大小為1.6×I.5×05cm，如做快速切片，則厚度不能超過(guò)0.2cm4、固定前的處理：組織塊固定時(shí)，不要彎曲扭轉(zhuǎn)，腸壁、胃壁、膽囊壁等，可先行平放在硬紙片上，然后慢慢放入固定液中。二、固定采取的病理材料必須立即放入固定液中。這樣細(xì)胞迅速死亡，能夠保持細(xì)胞原有的形狀和構(gòu)造組織所用的固定液不能太少，一般應(yīng)為組織塊體積的10倍，常用的固定液是95%酒精，10%中性甲醛（福爾馬林）溶液，還可用混合固定液，如酒精福爾馬林液、辛克氏液。三、脫水：組織經(jīng)固定和水洗后，組織中含有多量水分，必須先把組織內(nèi)的水分除去。脫水劑必須是與水在任何比率下均能混合的液體。脫水劑兼有硬化組織的作用。最常

29、用的脫水劑為酒精、丙酮等。1、酒精：脫水的程序?yàn)?0%80%95%100%。各級(jí)酒精24小時(shí)，100%酒精有硬化組織的作用，脫水時(shí)間不宜太長(zhǎng)，一般不超過(guò)3小時(shí)。2、丙酮：脫水力與收縮力比酒精強(qiáng)，為了避免組織過(guò)度收縮要先經(jīng)過(guò)低濃度丙酮（40%丙酮），再放入純丙酮中，每級(jí)浸1小時(shí)。四、透明：透明對(duì)組織有脫酒精及透明兩種作用，具有這種作用的試劑稱為透明劑。常用二甲苯、松油醇等。 五、透蠟：透蠟時(shí)間以能取代組織內(nèi)的全部透明劑，并充分滲入石蠟為原則。先將組織塊放入二甲苯加石蠟各半的混合液中，于5258溫箱內(nèi)放置1小時(shí)，然后將標(biāo)本移入保持在5258。溫箱中的石蠟23小時(shí)，或更長(zhǎng)時(shí)間。一般的浸蠟時(shí)間為46小

30、時(shí)。如用松油醇、香柏油透明，則要延長(zhǎng)透錯(cuò)時(shí)間。六、包埋：將融解的石蠟倒入金屬包埋框中再將透過(guò)錯(cuò)的組織塊放入包埋框的中央，并將預(yù)備切的組織面向下，等到石蠟表面形成薄膜時(shí)，立即將包理器沉入冷水內(nèi)1520min，取出石蠟塊按照組織塊大小劃分若干塊加以修整。七、切片：將蠟塊固定在石蠟切片機(jī)上，使蠟塊的切面與刀口成平行方向，刀的傾斜度通常為15度，轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤(pán)，調(diào)整切片厚度，切成46µm厚度的切片。持毛筆輕輕拔起切片，然后把切片放入3540的溫水皿中展平。切片移鋪在徐有蛋白甘油的載玻片上，進(jìn)入烤片箱（4050，勿高于熔點(diǎn)），烘烤424時(shí)。八、染色1、染色前的推備工作：組織片經(jīng)二甲苯脫蠟1020mi

31、n，然后脫二甲苯從100%、95%、80%、70%、50%酒精各25min左右，然后水洗5min。2、對(duì)比染色法：蘇木素-伊紅染色法的染色順序：1) 切片經(jīng)脫蠟到水洗2) 移入Harris蘇木素液15min（淋巴組織染色時(shí)間要縮短），蘇木素主要染細(xì)胞核。3) 水洗4) 移入1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘至半分鐘（退去跑漿顏色，保存細(xì)胞核顏色，此種區(qū)別作 用稱為分化）。5) 中和，在加數(shù)滴飽和碳酸鋰溶液的水中處理半分鐘。6) 流水充分洗滌。7) 移入05%1%伊紅酒精溶液復(fù)染半分鐘（主要染細(xì)胞漿）。8) 脫水，95%和100%酒精各10min。9) 透明，二甲苯透明1015min。10) 封固，切片上滴

32、加中性加拿大樹(shù)膠，然后覆蓋上蓋玻片，干后即可應(yīng)用。第四章 免疫學(xué)檢疫方法 第一節(jié) 常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)一、凝集試驗(yàn)病原體顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體混合后，在適宜的電解質(zhì)環(huán)境下，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的凝集物，這種現(xiàn)象稱為凝集試驗(yàn)。參于凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原。參與凝集反應(yīng)的抗體稱為凝集素?？乖贵w反應(yīng)時(shí)，按一定方法將抗原或抗體稀釋，出現(xiàn)明顯反應(yīng)終點(diǎn)的抗體或抗原的最高稀釋度稱為效價(jià)或滴度。（一）直接凝集試驗(yàn)1、試管凝集試驗(yàn)（一種定量實(shí)驗(yàn)） 2、玻板凝集試驗(yàn)（二）間接凝集試驗(yàn)將可溶性抗原或抗體吸附于一定分子表面，吸附抗原或抗體的載體顆粒與相應(yīng)的抗體或抗原特異性結(jié)合，則可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象

33、，稱為間接凝集反應(yīng)。間接凝集試驗(yàn)依據(jù)使用載體的不同，一般分為間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、炭凝集試驗(yàn)等。1、間接血凝試驗(yàn)：將紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)鞣酸或其他偶聯(lián)劑處理，使多糖抗原、蛋白質(zhì)抗原或抗體被紅細(xì)胞表面的受體結(jié)合或吸附，這種被致敏的紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體或抗原特異性結(jié)合，可形成肉眼可見(jiàn)的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。2、間接乳膠凝集試驗(yàn)：以聚苯乙烯乳膠作為載體3、間接炭粉凝集試驗(yàn)：用活性炭作為致敏載體（三）血凝試驗(yàn)與凝集抑制試驗(yàn)?zāi)承┎《净虿《狙兀墒鼓撤N或某幾種動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)生凝集，病毒的這種特性稱為血凝性。這種凝集現(xiàn)象可被特異性病毒抗血清或抗體所抑制，稱為血凝抑制。二、沉淀試驗(yàn)（一）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)在小口徑試管或發(fā)酵管

34、內(nèi)先加入已知抗血清，然后小心加入待檢抗原于血清表面，使兩種液體分界清楚。數(shù)分鐘，由于抗原和抗體發(fā)生結(jié)合，兩層液面交界處出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀。（二）絮狀沉淀試驗(yàn)：一定電解質(zhì)環(huán)境下，抗原和相應(yīng)抗體以一定比例在試管內(nèi)或凹玻片內(nèi)混合，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀或顆粒狀沉淀，絮狀沉淀試驗(yàn)可用于毒素和抗毒素測(cè)定。（三）免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1、單向單擴(kuò)散：將抗血清加于溶化的瓊脂中，用毛細(xì)吸管分裝于內(nèi)徑3mm的小試管，凝固后在其上滴加待檢抗原，置密閉濕盒內(nèi)，恒溫下擴(kuò)散。2、單向雙擴(kuò)散：將含有抗體的瓊脂加于管底，中間加一層不含抗原同濃度的瓊脂，凝固后加待檢抗原。3、雙向單擴(kuò)散：將抗血清入瓊脂中，澆成凝膠板，厚度2

35、3mm，在上面打孔，孔內(nèi)滴加抗原，抗原在孔內(nèi)向四周輻射擴(kuò)散，與凝膠中的抗體結(jié)合形成白色沉淀環(huán)，換的大小與抗原濃度成正比。4、雙向雙擴(kuò)散（常用）三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（一）包括兩個(gè)系統(tǒng)：1、檢測(cè)系統(tǒng)：又稱為溶菌系統(tǒng)，由已知的抗原或抗體、待檢的抗體或抗原以及補(bǔ)體組成。豚鼠血液中補(bǔ)體含量高，故常用新鮮的豚鼠血清代替補(bǔ)體。2、指示系統(tǒng)：又稱溶血系統(tǒng)，由綿羊紅細(xì)胞和溶血素組成，溶血素系抗綿羊紅細(xì)胞的抗體。指示系統(tǒng)中綿羊紅細(xì)胞與溶血素特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，不僅可以結(jié)合補(bǔ)體，而且在結(jié)合補(bǔ)體后出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。如果發(fā)生溶血反應(yīng)，說(shuō)明補(bǔ)體結(jié)合了綿羊紅細(xì)胞溶血素形成的抗原抗體復(fù)合物，證明檢測(cè)系統(tǒng)中抗原與抗體不存在特

36、異對(duì)應(yīng)關(guān)系。（二）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作一般分預(yù)備試驗(yàn)和正式試驗(yàn)兩步進(jìn)行1、預(yù)備試驗(yàn)：包括溶血素效價(jià)測(cè)定，補(bǔ)體效價(jià)測(cè)定，抗原或抗體效價(jià)測(cè)定，以確定溶血素、補(bǔ)體、抗原或抗體的最適濃度和用量。2、正式試驗(yàn)：將檢測(cè)系統(tǒng)之抗原或抗體、補(bǔ)體依次加入反應(yīng)管中，在一定溫度下感作一定時(shí)間后，加溶血素和紅細(xì)胞，再感作一定時(shí)間后，判定結(jié)果。第二節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)利用熒光素、酶和放射性元素等作為標(biāo)記物質(zhì)，標(biāo)記抗體或抗原分子用以示蹤抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)物理、化學(xué)等手段進(jìn)行檢測(cè)，使不易觀察的抗原抗體反應(yīng)放大并轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)的或可檢測(cè)的反應(yīng)，稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。分為免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)。一、免疫熒光技術(shù)也稱熒

37、光抗體技術(shù)，主要熒光色素有異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明和四甲基異硫氰酸羅丹明，標(biāo)記在抗體或抗原上，與相應(yīng)的抗原或抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光反應(yīng)。通過(guò)觀察標(biāo)記熒光素呈現(xiàn)的熒光反應(yīng)，檢測(cè)分析特異性抗原或抗體的存在。（一）基本方法1、直接熒光抗體技術(shù)：將標(biāo)記的特異熒光抗體直接滴加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間的染色，洗滌除去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下檢查抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物發(fā)出的熒光。2、間接熒光抗體技術(shù)：用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，作用一定時(shí)間后，洗滌除去未反應(yīng)的抗體，再用熒光素標(biāo)記的抗抗體與抗原標(biāo)本反應(yīng)。3、補(bǔ)體熒光抗體

38、技術(shù)：將未標(biāo)記的抗體和補(bǔ)體加在抗原標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，洗滌，然后再加標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體。(二）檢測(cè)標(biāo)本制備鏡檢標(biāo)本的制備一般包括制片和固定兩大步驟。1、制片：（1）涂片和壓印片：涂片染色檢查是診斷工作中最常應(yīng)用的方法，適于感染動(dòng)物的組織病料以及血液、膿、尿、糞便和穿刺液等。涂片方法按常規(guī)進(jìn)行。壓印片是將被檢組織塊切開(kāi)，以載玻片在切面上輕壓，使之粘上12層細(xì)胞。也可直接觸壓器官表面制片。自然干燥后進(jìn)行固定。（2）冰凍切片和石蠟切片：冰凍切片：感染動(dòng)物組織切成約3mm見(jiàn)方的小塊，置冷臺(tái)上，以6%明膠液作支持物，迅速冷凍至1520后切片，片厚48µm。（3）組織培養(yǎng)單層細(xì)胞：蓋玻片切成寬約

39、45mm的飛片，裝入小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，按常規(guī)方法培養(yǎng)各該病毒的敏感細(xì)胞。待細(xì)胞在飛片上長(zhǎng)成單層時(shí)，即可接種病料，經(jīng)不同時(shí)間后取出被感染的細(xì)胞飛片。2、固定：用的固定液為丙酮二、免疫酶技術(shù)是將抗原抗體分子結(jié)合的特異性與酶促化學(xué)反應(yīng)的敏感性有機(jī)結(jié)合而建立的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。常用的酶和底物：（1）辣根過(guò)氧化物酶：底物為過(guò)氧化氫（2）堿性磷酸酶：底物硝基苯磷酸鹽（一）免疫酶技術(shù)基本方法免疫酶技術(shù)在方法上分為兩類(lèi)，一類(lèi)用于組織細(xì)胞中的抗原或抗體成份檢出和定位，稱為免疫酶組織化學(xué)法或免疫酶染色法；另一種用于檢測(cè)液體中可溶性抗原或抗體成分，稱為免疫酶測(cè)定法。1、 免疫酶染色法：本方法與免疫熒光技術(shù)相同，只是以酶代

40、替熒光素作為標(biāo)記物，并以底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物為標(biāo)志。常規(guī)免疫酶染色法可分為直接和間接兩種方法。A、直接法：將被檢抗原吸附于固相載體（96孔聚苯乙烯反應(yīng)板），孵育后洗去未吸附的抗原，加入特異性的酶標(biāo)抗體，洗滌出去未反應(yīng)的物質(zhì)，加入底物，底物被分解出現(xiàn)顏色變化，顏色變化與抗原量呈正比。B、間接法：一般檢測(cè)抗體將一直抗原吸附于固相載體，孵育后洗去未吸附的抗原，隨后加入被檢血清，洗滌出去未反應(yīng)的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的抗抗體，反應(yīng)后再洗滌，再入底物，出現(xiàn)顏色變化，顏色變化的程度和速度與樣品中的抗體量呈正比。C、雙抗體夾心法：檢測(cè)抗原，將特異性免疫球蛋白吸附于固相載體表面，然后加入含有抗原的溶液洗除多余的抗原，再

41、加入酶標(biāo)記的特異性抗體，反應(yīng)后沖洗，加入酶底物，顏色改變與抗原量成正比。D、競(jìng)爭(zhēng)法：測(cè)抗原將抗體吸附于固相載體表面，孵育后沖洗，加入待檢抗原樣品和酶標(biāo)記抗原，反應(yīng)后沖洗，加入酶的底物溶液，發(fā)生顏色變化。2、免疫酶測(cè)定法：免疫酶測(cè)定法分均相免疫酶測(cè)定法和固相免疫酶測(cè)定法兩類(lèi)。固相免疫酶測(cè)定法以ELISA應(yīng)用最為廣泛。3、酶結(jié)合物的制備：有戊二醛法和過(guò)碘酸鈉法。三、放射免疫測(cè)定是將放射性同位素的高靈敏示蹤技術(shù)與抗原抗體特異性反應(yīng)有機(jī)結(jié)合用以測(cè)定介質(zhì)中微量活性物質(zhì)的一種檢測(cè)方法。常用的放射性同位素有3 H、125I、131I（一）放射免疫測(cè)定原理由標(biāo)記抗原（Ag*）與未標(biāo)記待檢抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性地與

42、特異性抗體（Ab）相結(jié)合，當(dāng)反應(yīng)液中存在一定量的*Ag和Ab時(shí)，結(jié)合型*Ag-Ab（B）和游離型*Ag（F）的比例是一定的，保持著可逆的動(dòng)態(tài)平衡。在該反應(yīng)系統(tǒng)中加入待檢的Ag，則Ag和*Ag競(jìng)相與Ab結(jié)合，Ag的量越多，B/F值或B%越小。然后分別測(cè)定B和F的比放射性，即可計(jì)算出B/F值，用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)Ag和一定量的*Ag、Ab反應(yīng)，測(cè)出不同濃度Ag的B/F值或B%，以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度為橫座標(biāo)，B/F或B%為縱座標(biāo)即可繪成競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同上法測(cè)出待檢抗原的B/F或B%，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其含量。第三節(jié) 變態(tài)反應(yīng)變態(tài)反應(yīng)（allergy）是指已免疫的動(dòng)物機(jī)體在再次接觸同一種抗原物質(zhì)時(shí)

43、所發(fā)生的一種異常反應(yīng)，也叫超敏反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生包括致敏階段和反應(yīng)階段兩個(gè)過(guò)程。一般具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：需有過(guò)敏原的刺激；過(guò)敏原高度特異性，兩次過(guò)敏原必須相同；需經(jīng)一定潛伏期，先使機(jī)體致敏，才能引起變態(tài)反應(yīng)；變態(tài)反應(yīng)的表現(xiàn)與反應(yīng)的程度既決定于抗原的質(zhì)和量，也決定于機(jī)體的反應(yīng)性差別。一、變應(yīng)原引起變態(tài)反應(yīng)的抗原稱為變應(yīng)原，變應(yīng)原種類(lèi)很多，可以是完全抗原，如微生物、寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)毒液、異種動(dòng)物血清和組織提取物、疫苗、動(dòng)物皮毛和飼料等；也可以是半抗原，如青霉素、磺胺類(lèi)藥物、阿斯匹林等常用藥物和有機(jī)碘、汞劑等一些化學(xué)制劑，這些半抗原只有與蛋白質(zhì)結(jié)合后才表現(xiàn)變應(yīng)原性。二、變態(tài)反應(yīng)分類(lèi)I型（過(guò)敏反應(yīng)）、型（

44、細(xì)胞毒型）、型（免疫復(fù)合物型）和型（遲發(fā)型）。前三型屬體液性變態(tài)反應(yīng)，其共同點(diǎn)是反應(yīng)發(fā)生較快，有的在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到反應(yīng)高峰，常稱為速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。第型為細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，反應(yīng)發(fā)生緩慢，一般在648小時(shí)才達(dá)到反應(yīng)高峰，故稱為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。（一）I型變態(tài)反應(yīng)：出現(xiàn)迅速、反應(yīng)強(qiáng)烈。反應(yīng)可限于一種組織，也可波及全身。所表現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度差異較大，但很多時(shí)候是致命性的全身反應(yīng)。（二）型變態(tài)反應(yīng)：是抗體（1gG或IgM）與相應(yīng)的細(xì)胞或組織上的抗原結(jié)合，在補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞和K細(xì)胞的參與下，造成細(xì)胞溶解、損傷，或被單核細(xì)胞所吞噬的反應(yīng)。臨診上許多免疫性血液病均屬此型。（三）型變態(tài)反應(yīng)：當(dāng)抗原進(jìn)入已免疫的機(jī)體內(nèi)

45、，與抗體（1gG、IgM）在循環(huán)或體液中結(jié)合，形成中等大小的抗原-抗體復(fù)合物，若不能及時(shí)被清除，便沉積于局部毛細(xì)血管壁基底膜，激活補(bǔ)體、導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，引起血管炎癥，危害機(jī)體。因免疫復(fù)合物可經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)遍布全身，故常引起全身反應(yīng)。（四）IV型變態(tài)反應(yīng)：是機(jī)體再次接觸同種抗原許多小時(shí)后發(fā)生的一種以細(xì)胞免疫局部反應(yīng)為主的反應(yīng)。該型變態(tài)反應(yīng)是以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的滲出性炎癥反應(yīng)。三、動(dòng)物疫病的變態(tài)反應(yīng)診斷 最常見(jiàn)：結(jié)核、馬鼻疽、布氏桿菌病 常用方法：皮內(nèi)反應(yīng)、點(diǎn)眼、皮下反應(yīng)第六章 病毒學(xué)檢疫技術(shù)第一節(jié) 病毒樣品的采集和預(yù)處理一、樣品的實(shí)驗(yàn)室處理（一）組織器官樣品的處理敗涂地 （二）糞便樣品的處

46、理二、病毒的濃縮 對(duì)病毒含量很少的病毒樣品，必須經(jīng)過(guò)濃縮處理。1、聚乙二醇（PEG）濃縮 將分子量6000的PEG逐步加入經(jīng)一般處理的樣品溶液中，使終濃度為8%，置4過(guò)夜。3000×g離心15min，用少量含復(fù)合抗生素的PBS液重新懸浮。2、硫酸銨濃縮：將等量飽和硫酸銨溶液緩慢加入經(jīng)過(guò)上述一般處理的樣品溶液中，邊加邊攪拌，置過(guò)夜，離心同上。3、超濾器濃縮：可將250500ml的樣品濃縮至20ml左右。4、超速離心濃縮：將病毒樣品40000rpm離心60120min，絕大多數(shù)病毒將沉于管底。用少量PBS溶液懸浮病毒。僅適用于小體積的樣品。 第二節(jié) 病毒增殖、分離技術(shù)一、動(dòng)物增殖、分離病

47、毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒接種法：腦內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈、腹腔接種法 二、禽胚增殖分離病毒（1）羊膜腔接種：用于正粘病毒、副粘病毒的增殖和分離，初代分離時(shí)羊膜腔接種比尿囊腔接種敏感，用1112日齡。（2）絨毛尿囊膜接種：用于痘病毒、皰疹病毒的增殖和分離，取1012日齡禽胚。（3）尿囊腔接種：用于正粘病毒、副粘病毒的增殖和分離，取911日齡禽胚。（4）卵黃囊接種：用蟲(chóng)媒披膜病毒、鸚鵡熱衣原體、立克次氏體的分離和增值。禽胚接種后，一般3739，孵化27天，每天照蛋12次，棄去接種后24小時(shí)死亡的雞胚，24小時(shí)后死亡的雞胚取出后4冷凍4小時(shí)收獲病毒。三、組織細(xì)胞增殖分離病毒細(xì)胞培養(yǎng)分為單層細(xì)胞培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

48、。單層細(xì)胞培養(yǎng)包括靜置培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使細(xì)胞在器皿的表面生長(zhǎng)出單層或數(shù)層細(xì)胞。單層細(xì)胞常用來(lái)分離和繁殖病毒。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，是指細(xì)胞懸浮于營(yíng)養(yǎng)液中繁殖的一種培養(yǎng)方法，它可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)，常用來(lái)繁殖病毒生產(chǎn)疫苗。根據(jù)細(xì)胞株的不同，細(xì)胞培養(yǎng)又分為原代細(xì)胞培養(yǎng)、繼代細(xì)胞培養(yǎng)、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)等。原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從組織消化分散的細(xì)胞進(jìn)行的第一代體外培養(yǎng)，繼代細(xì)胞培養(yǎng)是指將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來(lái)后再作培養(yǎng)，如果培養(yǎng)條件合適，細(xì)胞可連續(xù)傳代多次傳代細(xì)胞系也可通過(guò)來(lái)源于人和動(dòng)物體的腫瘤組織獲得。由于遺傳突變或者在化學(xué)物質(zhì)以及致瘤病毒的作用之下，繼代培養(yǎng)細(xì)胞中有時(shí)出現(xiàn)惡性

49、變異細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞具有很高的生長(zhǎng)和繁殖勢(shì)能，幾乎可以無(wú)限制地傳代，稱為傳代細(xì)胞，傳代細(xì)胞系也可通過(guò)來(lái)源于人和動(dòng)物體的腫瘤組織獲得。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法1、原代細(xì)胞的培養(yǎng)（1）選擇910日齡雞胚（或1214日齡鴨胚），用70%75%酒精消毒胚蛋外殼。（2）從氣室端打開(kāi)卵殼。取出雞胚，取頭、腳和內(nèi)臟，將軀干置于一滅菌小燒杯內(nèi)，用預(yù)冷的PBS溶液沖洗，用滅菌剪刀剪碎,加入PBS液沖洗組織碎塊，出去血液。（3）加入46倍體積的胰蛋白酶溶液，37消化1030分鐘，每隔10分鐘搖動(dòng)一次。（4）去掉上清液，加入PBS洗滌2次。（5）去掉上清液，加細(xì)胞生長(zhǎng)液制成10%的懸液，于4可保存34天；做細(xì)胞培養(yǎng)用，

50、則再作140的稀釋（終濃度1400），然后分裝到培養(yǎng)瓶中，于37培養(yǎng)48小時(shí)。2、繼代細(xì)胞的培養(yǎng)（1）侵出培養(yǎng)瓶中原有的細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入無(wú)鈣、鎂的PBS沖洗一次細(xì)胞表面。（2）加入胰蛋白酶溶液，室溫下不時(shí)搖動(dòng)細(xì)胞瓶，直至細(xì)胞瓶發(fā)白、卷邊，即將脫落。（3）侵出消化液，輕拍輕拍細(xì)胞瓶，搖散細(xì)胞，再加入細(xì)胞液，并進(jìn)一步搖散細(xì)胞。（4）根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，分裝24個(gè)細(xì)胞瓶，培養(yǎng)于適宜溫度，應(yīng)于36小時(shí)長(zhǎng)成單層。3、病毒接種（1）選擇新長(zhǎng)滿的細(xì)胞單，棄掉舊的細(xì)胞生長(zhǎng)液，每個(gè)細(xì)胞瓶，以浸沒(méi)細(xì)胞單層為宜。置37吸附60min。若樣品溶液很少以致不能浸沒(méi)細(xì)胞單層時(shí)，可將細(xì)胞瓶置于搖床上，緩慢搖動(dòng)，使樣品不斷浸潤(rùn)

51、全部細(xì)胞單層。（2）補(bǔ)加5倍或10倍于樣品溶液的細(xì)胞維持液于37培養(yǎng)。（3）每天觀察細(xì)胞病變（CPE），當(dāng)發(fā)生CPE時(shí)，做進(jìn)一步鑒定。第三節(jié) 病毒鑒定一、理化特性鑒定氯仿敏感性試驗(yàn)、酸敏感性試驗(yàn)、熱敏感性試驗(yàn)、陽(yáng)離子穩(wěn)定性試驗(yàn) 二、電子顯微鏡觀察（一）樣品制備1、糞便：用蒸餾水將糞便制成10%懸液，加入滅菌玻璃珠打勻，對(duì)半加入氟利昂混勻，以1000×g離心10min，取水相進(jìn)行濃縮病毒。用幾滴蒸餾水重懸沉淀作為觀察樣品。2、病毒細(xì)胞培養(yǎng)物：當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，凍融1-3次，以1000×g離心10min去渣，上清液按上文方法進(jìn)行病毒濃縮，用幾滴蒸餾水重懸沉淀作為觀察樣品。3、

52、膿汁或C外樣品：將樣品在載玻片制成抹片自然干燥，以少量蒸餾水重新懸浮樣品材料。（二）負(fù)染技術(shù) 1、等量病毒懸液與2%的磷鎢酸染液混合。 2、滴加到有支持膜的金屬載網(wǎng)上。3、吸去過(guò)多的病毒然也混合物，電鏡下觀察。（三）免疫復(fù)合物的電鏡觀察1、選擇高滴度的病毒作為抗原，2、用等量經(jīng)適當(dāng)稀釋的抗血清對(duì)少量病毒進(jìn)行處理，置于一密封容器中，37感作1小時(shí)3、加一滴每種方法處理的病毒樣品于載網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸鉀染色，電鏡觀察。4、通過(guò)觀察免疫血清與病毒粒子的特異性凝集而形成的大顆粒復(fù)合物以鑒定病毒。第七章 寄生蟲(chóng)學(xué)檢疫技術(shù)第一節(jié) 糞便寄生蟲(chóng)檢查一、糞便檢查基本方法（一）肉眼觀察：是檢查寄生蟲(chóng)的基本方法。

53、寄生于動(dòng)物消化道的絳蟲(chóng)會(huì)不斷隨宿主糞便排出呈斷續(xù)面條狀（白色）的孕卵節(jié)片；其他一些消化道寄生蟲(chóng)有時(shí)也可隨糞便排出體外。（二）涂片檢查：取50甘油水溶液或普通水12滴放于載玻片上，直接取黃豆大小的被檢糞便（塊）與之混勻，剔除粗糞渣，加蓋玻片，鏡檢蟲(chóng)卵。但檢出率不高。（三）蟲(chóng)卵漂浮法：主要用于檢查線蟲(chóng)卵、絳蟲(chóng)卵及球蟲(chóng)卵囊等。取大約10g糞便弄碎，放于一容器內(nèi)，加入適量飽和鹽水?dāng)噭蜻^(guò)濾，靜置0.5h左右，用直徑0.51.0cm的金屬圈蘸取表面液膜，抖落于載玻片上，加蓋玻片后鏡檢；常用的漂浮液還有亞硫酸鈉飽和液、硫酸鎂飽和液、硝酸鈉飽和液、硝酸銨飽和液、硝酸鉛飽和液等。檢查相對(duì)密度較大的蟲(chóng)卵，如棘頭蟲(chóng)

54、蟲(chóng)卵、豬肺絲蟲(chóng)蟲(chóng)卵及吸蟲(chóng)卵時(shí)，需用硫酸鎂、硫代硫酸鈉以及硫酸鋅等飽和溶液。（四）蟲(chóng)卵沉淀法：取一定量的糞便（大約5l0g）搗碎，放于一容器內(nèi)，加510倍量清水?dāng)噭?，?jīng)4060孔銅篩濾去大塊物質(zhì)后，讓其自然沉淀約20min，將上清液倒掉，再加入清水?dāng)噭?，再沉淀。如此反?fù)進(jìn)行23次，至上清液清亮為止。最后傾倒掉大部分上清液，留約為沉淀物2倍的溶液量，用膠帽吸管吹吸均勻后，吸取少量于載玻片上，加蓋玻片鏡檢。使用離心沉淀法取代自然沉淀法，可以大大縮短沉淀的時(shí)間。（五）蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)法：常用的方法有麥克馬斯特氏法，計(jì)數(shù)時(shí)，取2g糞便弄碎，放入裝有玻璃珠的小瓶?jī)?nèi)，加入飽和鹽水58ml充分震蕩混合，通過(guò)糞篩過(guò)濾。

55、然后將濾液邊搖晃邊用吸管吸取少量，加入計(jì)數(shù)室內(nèi)，放于顯微鏡載物臺(tái)上，靜置幾分鐘后，用低倍鏡將兩個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)見(jiàn)到的蟲(chóng)卵全部數(shù)完，取平均值乘以200，即為每克糞便中的蟲(chóng)卵數(shù)。（六）幼蟲(chóng)培養(yǎng)法：常用的方法是在培養(yǎng)皿底部加濾紙一張，而后將欲培養(yǎng)的糞便加水調(diào)成硬糊狀，塑成半球形，放于皿內(nèi)的紙上，并使半球形糞球的頂部略高出平皿邊沿，使加蓋時(shí)與皿蓋相接觸。將此皿置2530ºC溫箱（夏季放置室內(nèi)即可）中培養(yǎng)，注意保持皿內(nèi)濕度（應(yīng)使底部的墊紙保持潮濕狀態(tài)）。7l5d后，多數(shù)蟲(chóng)卵即可發(fā)育成第三期幼蟲(chóng)，并集中于皿蓋上的水滴中。將含有幼蟲(chóng)的水滴吸出置載玻片上，用顯微鏡檢查。（七）幼蟲(chóng)分離法：又稱貝爾曼氏法，用

56、一小段乳膠管兩端分別連接漏斗和小試管，然后置漏斗架上，通過(guò)漏斗加40溫水至漏斗中部，漏斗內(nèi)放置上有被檢材料（糞便或組織）的糞篩或紗布。靜置13h后，大部分幼蟲(chóng)游走沉于試管底部。此時(shí)拿下小試管，吸棄上清液，取管底沉淀物鏡檢。也可將分離裝置放入溫箱內(nèi)過(guò)夜后檢查。也可用簡(jiǎn)單平皿法分離幼蟲(chóng)。取糞球若干個(gè)置于放有少量溫水（不超過(guò)40）的表面玻璃或平皿內(nèi)，經(jīng)10l5min后，取出糞球，吸取皿內(nèi)液體，在顯微鏡下檢查幼蟲(chóng)。（八）毛蚴孵化法：取被檢糞便30100g（牛100g）經(jīng)沉淀集卵法處理后，將沉淀倒入500ml三角燒瓶?jī)?nèi)。加溫清水（自來(lái)水需脫氯處理）至瓶口，置2226孵化。第1、3、5小時(shí)，用肉眼或放大鏡觀察并記錄一次。如見(jiàn)水面下有白色點(diǎn)狀物做直線來(lái)往運(yùn)動(dòng)，即是毛蚴，必要時(shí)吸出被檢液用顯微鏡觀察。第二節(jié) 組織寄生蟲(chóng)檢查一、血液寄生蟲(chóng)檢查（一）涂片鏡檢：一般在病畜體溫升高時(shí)采集耳靜脈血。用載玻片接觸最先流出的一滴血；或用注射器吸取血液滴于載玻片，制成血液涂片。干燥后用姬姆薩或瑞氏染色法染色鏡檢。（二）鮮血壓滴觀察：先將一滴生理鹽水置于載片上，然后滴上一滴被檢血液，充