中科院_生物化學與分子生物學考博補充一

1、生物膜的運輸機制？細胞膜物質轉運的方式有單純擴散，易化擴散，主動轉運，出胞與入胞各自特點和機制為： 單純擴散，脂溶性的小分子物質或離子從膜的高濃度側移向低濃度一側的現象稱為單純擴散。單純擴散的特點是，不需膜蛋白質幫助，不消耗細胞自身代謝能量，順濃度差進行，單 純擴散轉運的物質為脂溶性小分子物質易化擴散，指水溶性的小分子物質或離子在膜蛋白質的幫助下從膜的高濃度一側移向低濃度一側的轉運方式。易化擴散的類型有載體轉運。載體轉運的特點有特異性，飽和性，競爭性抑制。載體轉運轉運的物質：主要是水溶性小分子有機物。主動轉運，指在細胞膜上生物泵的作用下,通過細胞本身的耗能將物質從膜的低濃度一側向高濃度的轉運。

2、主動轉運轉運的物質主要是離子物質如鈉，鉀， 鈣 。 特點是需要生物泵作用，消化細胞自身代謝能量，逆濃度差進行。出胞與入胞，大分子物質從細胞內移向細胞外稱為出胞。大分子物質從細胞外移向細胞內稱為入胞。出胞與入胞轉運的物質為大分子物質。出胞與入胞的特點為需要細胞膜的運動，消耗細胞自身代謝能量。DNA 復制原理？DNA復制基本規(guī)律：復制過程為半保留方式；原核生物單點起始，真核生物多點起始，復制方向多為雙向，也有單向；復制方式呈多樣性，（直線型、Q型、滾動環(huán)型等）；新鏈合成需要引物 引物RNA長度一般為幾個10個核甘酸，新鏈合成方向5'- 3',與模板 鏈反向,堿基互補；復制為半不連續(xù)

3、的,以解決復制過程中,兩條不同極性的鏈同時延伸問題,即一條鏈可按5' - 3'方向連續(xù)合成稱為前導鏈，另一條鏈先按5' - 3'方向合成許多 不連續(xù)的岡崎片段（原核生物一般長1000-2000個核苷酸,真核生物一般長100-200個核苷酸）,再通過連接酶連接成完整鏈, 稱后隨鏈,且前導鏈與后隨鏈合成速度不完全致,前者快,后者慢. DNA 復制主要包括引發(fā)、延伸、終止三個階段.DNA 的復制 是一個邊解旋邊復制的過程.復制開始時,DNA 分子首先利用細胞提供的能量,在解旋酶的作用下,把兩條螺旋的雙鏈解開,這個過程叫解旋.然后 ,以解開的每一段母鏈為模板 ,以周圍環(huán)

4、境中的四種脫氧核苷酸為原料,按照堿基配對互補配對原則,在DNA 聚合酶的作用下,各自合成與母鏈互補的一段子鏈.隨著解旋過程的進行,新合成的子鏈也不斷地延伸,同時 ,每條子鏈與其母鏈盤繞成雙螺旋結構,從而各形成一個新的DNA 分子 .這樣,復制結束后 ,一個DNA 分子,通過細胞分裂分配到兩個子細胞中去!免疫共沉淀與ChiSeq原理。什么是 ChIP?ChIP 的原理很簡單：選擇性富集包含某一特異性抗原的染色體（質）片段。能夠識別某一蛋白或目的修飾蛋白的抗體被用來確定抗原在基因組中一處或多處的相對豐度。1、 分離總染色體（質） （需要通過交聯(lián)使目的抗原固定在染色體（質） 與其結合的部位）。2、將

5、染色體（質）切割成片段（以提高精度）。3、對切成片段的染色體（質）進行免疫沉淀。4、免疫沉淀的染色體（質）片段進行分析，確定靶DNA 序列水平與其輸入的染色體（質）的相對豐度。甲醛處理細胞-收集細胞，超聲破碎-加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA 復合物相互結合 -加入 ProteinA， 結合抗體-靶蛋白-DNA 復合物， 并沉淀-對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合-洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA 復合物 -解交聯(lián)，純化富集的DNA-片段-PCR分析。簡述真核生物5 帽子結構和功能。m 是甲基，m7G 指 7-甲基鳥嘌呤核苷酸m7G 是所有 mRNA 的帽子都有結構，它跟 5&

6、#39;-PPPN 相連 （即 mRNA5' 端起始三磷酸核苷酸）。帽子結構通常有三種：m7GPPPN ， m7GPPPNm ， m7GPPPNmNm 。它們分別被稱為O 型、I 型和 II 型mRNA的加工修飾包括：5 '端形成帽子結構、3'端軸lyA、剪接除去內含子和甲基化。在 5 -端加帽成熟的真核生物mRNA 的 5 -端有m7GPPPN 結構， 稱為甲基鳥苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，mRNA鳥音酰轉移酶，mRNA （鳥喋吟-7）甲基轉移酶和 mRNA （核苷 -2 ） 甲基轉移酶催化形成的。甲基化程度不同可形成3 種類型的帽子：CAP 0 型、 CAP I型

7、和 CAP II 型。鳥苷以5 - 5焦磷酸鍵與初級轉錄本的5 -端相連。真核生物帽子結構的復雜程度與生物進化程度關系密切。5帽子的功能mRNA 5 -端帽子結構是mRNA 翻譯起始的必要結構，對核糖體對mRNA的識別提供了信號，協(xié)助核糖體與mRNA 結合，使翻譯從AUG 開始。帽子結構可增加 mRNA的穩(wěn)定性，保護 mRNA免遭5' f3 '核酸外切酶的攻擊。在蛋白質合成過程中，它有助于核糖體對mRNA 的識別和結合，使翻譯得以正確起始。作用就有提高翻譯強度。防止轉錄產物被核酸酶降解。可以促進蛋白質生物合成中起始復合物的形成。缺失后，無法起始翻譯。有絲分裂及其調控（有絲分裂的

8、過程、變異及其調控前期（prophase） ：染色質逐漸凝縮變粗，起先是卷曲為一團亂麻，繼而能分清各個染色體，且明顯可以見到每條染色體都是由兩條染色單體構成的，兩條染色單體共用一個著絲點。核仁和核膜逐漸變得模糊不清。紡錘絲（spindle fiber）開始形成。中期（metaphase） ：核仁和核膜完全消失，紡錘體（spindle）明顯可見。從細胞的側面觀察，各個染色體的著絲點均排列在紡錘體中央的赤道面上，而其兩臂則自由地伸展在赤道面的兩側（圖mitosis-metaphase-cemianguan）此時，染色體具有典型的形狀，適于觀察和記數 （圖2-8-1）。后期（anaphase） ：每

9、個染色體的著絲粒分裂為二，每條染色體的兩條染色單體各自分開而成為兩條獨立的染色體， 并在紡錘絲的牽引下分別移向兩極。移向兩極的染色體數目是完全一樣的，且同分裂前母細胞的染色體數目、形態(tài)完全一樣（圖 mitosis-anaphase。）末期 （ telophase） ： 染色體已移至兩極（圖 mitosis-telophase）， 圍繞者染色體重新出現核仁核膜，染色體又重新變得松散細長，回復為染色質的狀態(tài)。至此，一個母細胞內形成了兩個子核。接著在紡錘體的赤道板區(qū)域形成細胞板，細胞質被分隔開,一個母細胞分裂為兩個完全相同的子細胞。繼而，子細胞又進入G1 期。以哺乳動物精子和卵子發(fā)生為例。簡述減數分

10、裂精子減數分裂時,初級精母細胞DNA 復制一次,然后進行一次分裂（即減數第一次分裂）形成兩個次級精母細胞,每個次級精母細胞再進行一次分裂（減數第二次分裂）,共形成四個精子卵細胞減數分裂時,初級卵母細胞DNA 復制一次,然后進行一次分裂（即減數第一次分裂）形成兩個大小不等的細胞,大的稱之為次級卵母細胞,小得稱之為第一極體.次級卵母細胞再分裂一次,再次形成兩個大小不等的細胞,大的即卵細胞,小的稱為第二極體.相同點：都是 DNA 復制一次而進行兩次分裂；都在減數第一次分裂發(fā)生同源染色體的配對以及同源染色體的分開；都在減數第二次分裂發(fā)生姐妹染色單體的分離；分裂后細胞內的染色體數都減半.不同點： 初級精

11、母細胞減數分裂的結果是形成四個精子而初級卵母細胞減數分裂的結果是形成一個卵細胞、一個第一極體和一個第二極體.試述細胞膜的化學組成流動鑲嵌模型模型認：細胞膜結構是由液態(tài)的脂類雙分子層中鑲嵌可以移動的球形蛋白質而形成的.隨著科學研究技術的不斷創(chuàng)新和改進,流動鑲嵌模型也逐步得到完善,是目前比較公認的膜結構模型.這一模型強調兩點：膜的流動性，膜蛋白和膜脂均可側向移動.膜蛋白分布的不對稱性,球形蛋白質有的鑲嵌在膜的內或外表面,有的嵌人或橫跨脂雙分子層.膜的流動性是細胞膜結構的基本特征之一,同時也是細胞膜表現其正常功能的必要條件.膜的流動性是指膜結構分子的運動性,它包括膜脂的運動和膜蛋白的運動.膜脂的流動

12、性膜脂的運動在正常生理狀況下,膜脂分子處于運動狀態(tài).膜脂的運動方式主要有側向擴散、旋轉運動、旋轉異構運動、左右擺動以及翻轉運動等.細胞膜中的蛋白質也能以側向擴散等方式運動.人們通過實驗已充分證實了膜蛋白的流動性.膜蛋白主要有以下幾種運動形式： 隨機移動有些蛋白質能夠在整個膜上隨機移動.移動的速率比用人工脂雙層測得的要低 .定向移動有些蛋白比較特別,在膜中作定向移動.例如,有些膜蛋白在膜上可以從細胞的頭部移向尾部. 局部擴散有些蛋白雖然能夠在膜上自由擴散,但只能在局部范圍內擴散其主要特點是：細胞膜不是靜態(tài)的,而是膜中的脂質和蛋白質都能自由運動.即是：磷脂雙分子層構成細胞膜的基本骨架,蛋白質分子貫

13、穿在磷脂雙分子層中或覆蓋有磷雙分子層表面.由于磷脂雙分子層可以運動、蛋白質分子可以運動,所以整個膜是可流動的。給你一個新基因，如何研究它的功能基因功能的研究思路主要包括:1 .基因的亞細胞定位和時空（發(fā)育期或梯度藥物處理濃度,不同組織/器官）表達譜;2 .基因在轉錄水平的調控（可以通過genome walking PCR 或通過已有的資源庫尋找該基因的啟動子等轉錄調控區(qū)域,通過單雜交或ChIP 等技術,尋找該基因的轉錄調控蛋白）3 .細胞生化水平的功能研究（也就是蛋白蛋白作用復合體的尋找驗證,具體方法有酵母雙雜交 ,GST pulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc 等等,對該

14、基因的表達產物做一個細胞信號轉導通路的定位 ）4 .gain-of-function & loss-of-function: 也就是分別在細胞和個體水平,做該基因的超表達和knockdown（或knockout）,從表型分析該基因的功能 .功能研究應從完整的分子-細胞-個體三個層次研究,綜合分析.關于基因的表達和定位,可以這樣去做：1 .mRNA 水平檢測基因表達：選擇表達目的基因的組織/細胞（發(fā)育不同時期、機體不同部位、加處理因素 ），提取RNA,反轉錄，做RT-PCR或real time RT-PCR,檢測基因的表達情況/變化 .（或者以northern blot、Rnase pr

15、otection assa昉法,檢測基因的 mRNA表達情況/變化.）2 .蛋白質水平檢測基因表達：選擇相應的組織/細胞，以Western blot、免疫組化（OR免疫熒光 ）檢測目的蛋白的表達.3 .檢測目的蛋白的細胞定位：將目的基因克隆至帶熒光標簽（如 GFP）的表達載體，在適合的模式細胞中表達,在活細胞中觀察蛋白的細胞定位.DNA 重組的意義簡述 RNA 剪接和蛋白質剪接RNA 剪接：將轉錄初始物中的內含子切除,緊接著將其編碼多肽鏈的外顯子連接在一起的過程.RNA 剪接方式：1 .一類內含子的自我剪接；2 .二類內含子的自我剪接；3 .核內mRNA 剪接體剪接；4 .核內前體tRNA 酶

16、促反應剪接.前兩類內含子的剪接方式都是兩次轉酯反應,區(qū)別就是第一次轉酯反應所用親核試劑不同；第三類剪接方式分為組成性剪接與選擇性剪接，前者識別5 '-GU AG3'內含子序列,而后包括可變poly A 位點和可變剪接方式；第四類需核酸酶及連接酶等工具酶,形成成熟 tRNA.蛋白質剪接是蛋白質內含肽介導的,一種在蛋白質水平上翻譯后的加工過程,它由一系列分子內的剪切一連接反應組成.蛋白質內含肽是一個蛋白質前體中的多肽序列,可以催化自身從蛋白質前體中斷裂,使兩側的蛋白質外顯肽連接成成熟的蛋白質.蛋白質內含肽的發(fā)現不僅豐富了遺傳信息翻譯后加工的理論, 在實踐中也有廣泛的應用前景.蛋白質

17、相互作用什么是反義RNA?真核生物中反義RNA調節(jié)基因表達的機理是什么 ？反義 RNA（antisense RNA） 是一類自身沒有編碼功能，但能通過配對堿基間氫鍵與目的RNA 特別是 mRNA 的特定區(qū)域補結合，從而抑制基因表達的小分子RNA。 一般將自然存在或人工合成的反義 RNA,通過基因重組反向插入到表達載體，以此轉染細胞、在細胞內產生大量反義RNA。其作用機理包括：1）與引物RNA結合或作用于引 物前體，阻止引物與DNA 結合，抑制DNA 復制； 2）在轉錄水平或轉錄后加工過程中，阻止特定基因轉錄，或與mRNA 5'端結合，阻止加帽過程；或與剪接位點結合，阻止mRNA 的剪接

18、形成等；3）與 SD序列或編碼區(qū)關鍵點如AUG 結合，阻止mRNA 與核糖體結合，阻斷翻譯等。反義 RNA 是指與目標RNA 具有互補序列的RNA 分子。反義RNA 通過序列互補與特定的mRNA結合，從而抑制 mRNA的翻譯?？键c反義RNA。由于通過反義 RNA與正鏈 RNA形成雙鏈RNA,可特異性地抑制靶基因；通過人為地引入與內源靶基因具有相同序列 的雙鏈RNA（有義RNA和反義 RNA）,可誘導內源靶基因的mRNA降解，達到阻止基因表達的目的。因此，反義RNA 的發(fā)現，為人為精細調控基因的表達提供了一條新的途徑。設計PCR 引物考量指標：主要是這么幾點注意的：1、引物長度一般為 15-30

19、bp,常用的為18-27bp,但不能大于38bp；2、引物GC 含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC 含量和 Tm 值要保持接近；3、引物所對應的模板序列的Tm 值最好在72左右，至少要在 55-80之間， Tm 值曲線以選取 72 度附近為佳，5'到 3 的下降形狀也有利于引物與模板的結合；4、AG值（自由能）反應了引物與*II板結合的強弱程度，3'端的AG值相對要低，且絕對值不要超過9,否則不利于正確引發(fā)反應， 3'末端雙鏈的 AG值在0-2kcal/mol時，PCR產量 幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%， -8 時少于20%， -1

20、0時接近于0；5、錯配率一般不要超過100，否則會出現非目的條帶。但對于某些特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為340以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為110，并且不好找到其他更合適的引物，那么這對引物是可以接受的；6、 Frq 曲線為 Oligo6 軟件新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重復幾率大小，選取引物時，應該用Frq 值相對較低的片段；7、 引物二聚體及發(fā)卡結構的能量的絕對值一般不要超過4.5， 否則容易產生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致PCR 不能正常發(fā)生；8、 3'端最好不要是連續(xù)堿基，GGG 或 CCC

21、會導致錯誤的引發(fā)，同時3'端最后一個堿基最好不要是A或T,若是，會導致錯配；9、以公式Tm=4* （ G+C ） +2*（ A+T ） -5計算 Tm 值，也就是退火溫度。選擇較低Tm 值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的Tm 值相匹配，且在70-75范圍內；10、模板與穩(wěn)定性較小的引物之間的Tm 的差異越小，PCR 的效率越高。因為解鏈溫度也取決于它的長度，如果期待的產物長度等于或小于500bp,選用端白引物（16-18bp）,如果產物長5kb,則用24bp的引物；11、 在 DNA 測序和 PCR 中最好用5'末端穩(wěn)定（GC 含量多） ，而3'端不

22、穩(wěn)定（AT 含量多）的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發(fā)反應；12、引物和產物之間的Tm 值相差別太大，20 攝氏度范圍內最好。13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據需要添加保護堿基。表觀遺傳，及調控方式，還有蛋白質通過哪些共價修飾調控其功能？表觀遺傳（epigeneticS）是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細胞內除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳改變從以下3 個層面上調控基因的表達，DNA 修飾： DNA 共價結合一個修飾基團，使具有相同序列的等

23、位基因處于不同的修飾狀態(tài)；蛋白修飾：通過對特殊蛋白修飾或改變蛋白的構象實現對基因表達的調控；非編碼 RNA 的調控：RNA 可通過某些機制實現對基因轉錄的調控以及對基因轉錄后的調控，如RNA 干擾 （RNA interference,RNAi） 。1）磷酸化：主要發(fā)生在 Ser,Thr和Tyr等三種氨基酸側鏈。由各種蛋白激酶催化。2）甲基化：由N-甲基轉移酶催化蛋白質的甲基化，甲基供體是5-腺昔蛋氨酸。該甲基轉移主要存在于細胞質內。甲基化位點主要在 Arg, His和GIn的側基的N-甲基化以及 Glu和Asp 側基的。-甲基化。3）乙?；篘-乙?；D移酶多肽鏈的 N端乙酰化。有兩組乙酰轉移

24、酶，都以乙酰 -CoA為?；w，一組為分泌非蛋白的乙酰轉移酶。4）腺苷酸化:將腺苷酸基團AMP 轉移到蛋白質的Thr 殘基的側鏈-OH 基上，使之發(fā)生腺苷酸化。5）糖基化：糖基化是真核生物細胞蛋白質特征之一。進入內質網膜或腔的蛋白質都被結合寡糖基團而糖基化。糖基化由ER 中的糖基化酶催化，極少數蛋白質能在胞質中被糖基化。糖基化類型：寡糖基團連接在 Asn側鏈上的-NH2上，形成N-糖昔鍵連接；寡糖基團與Ser,Thr的-OH基團連接，形成 O-糖昔鍵連接。2、蛋白質與DNA 結合的方法和比較，EMSA 和 DNase1 足跡法？螺旋-轉角-螺旋：螺旋一轉角一螺旋（helix-turn-hel

25、ix）是最初在 入噬菌體的阻遏蛋白中發(fā)現的一種DNA結合結構域。在阻遏蛋白氨基端有5段“螺旋，每段螺旋之間折轉成一定角度相連接，其中兩段負責同DNA 結合（圖 7： 6）。 。 螺旋 3 由 9 個氨基酸組成，與前面的由7個氨基酸組成的。螺旋2形成一個角度。a螺旋3通過氨基酸側鏈同 DNA堿基之間的氫鍵同DNA序列相結合，3個氨基酸識別3個堿基，所以a螺旋3被稱為識別螺旋（recognition helix）。a螺旋2則是通過氫鍵同 DNA的磷酸骨架相接觸。這種相互作用對于同DNA結合是必需的，但并不控制對靶序列識別的專一性。鋅指結構：鋅指（zinc finger） ：一種常出現在DNA 結合蛋白中的一種結構基元。是由一個含有大約30個氨基酸的環(huán)和一個與環(huán)上的4個Cys或2個Cys和2個His配位的Zn2+構成，形成的結構像手指狀。鋅指結構指的是在很多蛋白中存在的一類具有指狀結構的結構域，這些具有鋅指結構的蛋白大多都是與基因表達的調控有關的功能蛋白。鋅指結構的共同特征是通過肽鏈中氨基酸殘基的特征集團與Zn2+ 的結合來穩(wěn)定一種很短的，可自我折疊成“手指”形狀的的多肽空間構型。亮氨酸拉鏈：leucine zipper 一種蛋白質中常見的結構模體，由一組（通常是45個）重復片段組成， 每個重復片段的第7 個氨基酸殘基均為亮氨酸，兩條含有此模體的多肽鏈可形成