小鼠Toll樣受體4TLR4酶聯(lián)免疫分析

1、如有幫助，歡迎支持小鼠Toll樣受體4(TLR-4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書96T本試劑盒僅供研究使用。檢測(cè)范圍:0.7 ng/mL - 26n g/mL使用目的：本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中Toll樣受體4(TLR-4)含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠Toll樣受體 4(TLR-4)水平。用純化的小鼠Toll樣受體4(TLR-4)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Toll樣受體4(TLR-4)，再與HRP標(biāo)記的Toll樣受體4(TLR-4)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗 體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在 HR

2、P酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Toll樣受體 4(TLR-4)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠Toll樣受體4(TLR-4)濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20ml X1 瓶7終止液6ml X1 瓶2酶標(biāo)試劑6ml X1 瓶8標(biāo)準(zhǔn)品(48ng/mL )0.5ml X1 瓶3酶標(biāo)包被板12孔$條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X1 瓶4樣品稀釋液6ml X1 瓶10說明書1份5顯色劑A液6ml X1 瓶11圭寸板膜2張6顯色劑B液6ml X1/瓶12密封袋1個(gè)標(biāo)本要求1 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相

3、關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20 C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2 .不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。 操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。24n g/mL5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液12n g/mL4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液6n g/mL3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液3n g/mL2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5 ng/mL1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品15

4、0 d的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2. 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 M，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 M,然后再加待測(cè)樣品10 M （樣品最終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置 37C溫育30分鐘。4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50 U，空白孔除外。7. 溫育：操作

5、同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 4，再加入顯色劑 B50也輕輕震蕩混勻，37C避光顯色 15分鐘.10終止：每孔加終止液50 4，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止 液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)：準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37E反應(yīng)30分鐘洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37匸反應(yīng)30分鐘洗板5次，加入顯色液X B> 379顯色10分鐘加入終止液|15分鐘之矗0D值計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)

6、準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 0D值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（x nx。5封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物請(qǐng)避光保存。 7嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶