桂枝茯苓膠囊對體外人宮頸癌Hela細胞抑制作用及機理研究

1、桂枝茯苓膠囊對體外人宮頸癌Hela細胞抑制作用及機理研究    基金項目:浙江省教育廳基金資助項目(20060721) 作者簡介:黃燕芬(1974-),女,浙江金華人,副教授,主要從事中藥成分的分離與中藥藥理研究。 摘 要:目的:研究桂枝茯苓膠囊對體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用和作用機理的初步研究。方法:MTT比色法觀察桂枝茯苓膠囊對人宮頸癌Hela細胞增殖的抑制作用;免疫組化檢測Fas、Fas L、Bcl-2基因的表達;western-blot和RT-PCR檢測對人宮頸癌Hela細胞Caspase-3蛋白和Caspase-3 MRNA的表達

2、影響;DNA-Ladder檢測凋亡條帶。結(jié)果:桂枝茯苓膠囊對人宮頸癌Hela細胞有明顯的抑制作用(P關(guān)鍵詞:桂枝茯苓膠囊;宮頸癌Hela細胞;MTT;western-blot;免疫組化?Study of Inhibition and Mechanism on Hela of Guizhi Fuling Capsule in Vitro HUANG Yan?fen,DONG Gai?xia,CHAI Hui, YUAN Xiao?feng (Life Science Institute,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Z

3、hejiang,China)? Abstract:Objective: To study the effects on anti-proliferation and its mechanism on the Hela of Guizhifuling Capsule. Methods: The inhibitory effect on Hela cell proliferation was assayed by MTT. Fas,FasL,Bcl-2 gene's expression was detected by Immunohistochemistry. caspase-3 MRN

4、A and protein were detected by Western-blot and RT-PCR. Results: Guizhifuling Capsule have obvious effect on anti-proliferation of Hela cells (PKey words:Guizhifuling capsule; Hela; western-blot; immunohistochemistry; RT-PCR 宮頸癌是發(fā)生在全球婦女中僅次于乳腺癌的第2個常見的惡性腫瘤1。臨床上治療常用化療藥物,化療藥物副作用大,容易產(chǎn)生耐藥性。中藥治療腫瘤已經(jīng)越來越受醫(yī)務(wù)人

5、員和患者青睞。? 桂枝茯苓膠囊主要由桂枝、茯苓、桃仁、丹皮、赤芍等5味藥物組成。具有活血化瘀、消癥散、抗凝血、促進微循環(huán)、抗腫瘤等多種功效,現(xiàn)廣泛用于保守治療子宮肌瘤2-3。? 本實驗旨在觀察桂枝茯苓膠囊對體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細胞生長抑制作用,從誘導(dǎo)凋亡調(diào)控基因角度分析其抑制作用機制,為深度開發(fā)利用桂枝茯苓膠囊提供實驗依據(jù)。 1 主要試劑? 桂枝茯苓膠囊:購于康緣藥業(yè),國藥準字Z10950005,取桂枝茯苓膠囊1顆,溶于90%乙醇溶液中,靜置取上清液。水浴加熱揮發(fā)乙醇,殘留物溶于1mL DMSO中,除菌過濾備用。鹽酸多柔比星(阿霉素):購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H3302198

6、0(溶解成16g #8226;mL-1)。預(yù)染MAKER(12kd-94kd),兔抗人Fas IgG,兔抗人Fas-L IgG,兔抗人Bcl-2 IgG,生物素化羊抗兔IgG ,兔抗人Caspase-3多克隆抗體,生物素化羊抗兔IgG,DAB酶底物顯色劑盒,等均購自武漢博士德生物工程有限公司。caspase-3上游引物5-TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC-3;下游引物5-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3(400bp),-actin上游引物5-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3下游引物5-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3(125bp)引物均由上海生工生物工

7、程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 2 實驗方法 2.1 人宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)與分組? 將生長良好的人宮頸癌Hela細胞以1×105 #8226;mL-1接種于96孔培養(yǎng)板(每孔200L)、內(nèi)置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板(每孔2mL)、25mL培養(yǎng)瓶內(nèi)(每孔2mL),37、5% CO?2孵育24h,形態(tài)狀況良好的供實驗分組。? 96孔培養(yǎng)板隨機分3組:每組6孔,分別加200L培養(yǎng)液和10L生理鹽水、200L培養(yǎng)液和10L阿霉素、200L培養(yǎng)液和40L桂枝茯苓膠囊。37、5%CO?2繼續(xù)培養(yǎng)24h供相關(guān)檢測。? 6孔培養(yǎng)板和25mL培養(yǎng)瓶各自隨機分成3組,分別加2mL培養(yǎng)液和300L生理鹽水、2mL

8、培養(yǎng)液和300L桂枝茯苓膠囊、2mL培養(yǎng)液和100L桂枝茯苓膠囊藥,37、5%CO?2繼續(xù)培養(yǎng),24h供相關(guān)檢測。 2.2 檢查項目和方法 2.2.1 MTT檢測對人宮頸癌Hela細胞抑制作用將實驗組96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)液吸凈,每孔加入0.5mg #8226;mL-1 MTT 20L,繼續(xù)孵育4h,棄MTT液后每孔加DMSO 150L充分溶解深藍色結(jié)晶,450型酶標儀于波長570nm處測定吸光度(A)值,計算細胞生長抑制率(IR)。IR(%)=1-(空白對組A值-實驗組A值)/(空白對照組A值)×100%。       

9、; 2.2.3 western-blot檢測對人宮頸癌Hela細胞caspase-3的表達抽提實驗組25mL培養(yǎng)瓶細胞蛋白:加700L裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,經(jīng)常搖一搖,使細胞充分裂解。收集裂解液體,4,12000r/min離心5min,取上清分裝Eppendorf管中。Lowry法測定蛋白濃度。? 取15L左右(約含蛋白40g)SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。取出膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2h后,用含 0.05%Tween 20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次,每次 10min,加兔抗人Caspase-3多克隆抗體(11000)4孵育過夜,TBST漂洗

10、3次后加相應(yīng)的生物化素羊抗兔二抗(1500),37搖床溫育2h,DAB顯色系統(tǒng)顯色,拍照。 2.2.4 RT-PCR檢測對人宮頸癌Hela細胞Caspase-3的表達按TRIzol試劑說明書提取實驗組25mL培養(yǎng)瓶細胞RNA,紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度,純度要求為OD260/OD280>1.8,將濃度調(diào)整為0.2g/L,提取的總RNA進行cDNA合成。? RT-PCR反應(yīng)條件:混勻后421 h,95加熱5 min,快速冷卻到4。反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板,-20保存?zhèn)溆?。PCR擴增反應(yīng)體系及條件:Caspase-394 5min預(yù)變性,9445s,5245s, 7

11、21min,30個循環(huán); 72延伸10 min,產(chǎn)物4保存4。? 擴增產(chǎn)物經(jīng)25 g/L瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析系統(tǒng)進行拍照分析。 2.2.5 DNA Ladder檢測凋亡條帶按DNA ladder抽提試劑盒說明書提取實驗組25mL培養(yǎng)瓶細胞DNA,測定DNA濃度。? 取5L樣品加入1L Loading Buffer,1.5%瓊脂糖凝膠電泳75V/cm 電泳45 min,凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察拍照。 3 結(jié) 果 3.1 對人宮頸癌Hela細胞生長抑制作用? 桂枝茯苓膠囊40L時對Hela有抑制作用(?P?表1 桂枝茯苓膠囊對Hela抑制作用(?n?=6,?±s?) 組別用藥量ul平

12、均吸光度(A)抑制率(%) 空白對照2.5730±0.105 阿霉素101.3530±0.179 147.41 桂枝茯苓膠囊400.8596±0.133 1,236.47 注:與空白對照組比較,1?P?<0.01;阿霉素組和桂枝茯苓膠囊組比較,2?P?3.2 對人宮頸癌Hela細胞Fas Fas-L Bcl-2 的表達? 免疫組織化學(xué)染色顯示,空白對照組腫瘤細胞數(shù)量多,Fas和Fas-L染成棕黃色較少(見圖1、3);桂枝茯苓膠囊組大多數(shù)腫瘤細胞的胞質(zhì)和胞膜均有Fas、Fas-L蛋白陽性表達,呈棕黃色顆粒,多為灶狀分布或單個細胞散在分布(見圖2、4);Bcl-

13、2蛋白在空白對照組較多腫瘤細胞的胞質(zhì)和核膜呈陽性表達,陽性細胞多呈灶狀分布,少數(shù)細胞呈散在分布(見圖5);桂枝茯苓膠囊組只有少數(shù)細胞質(zhì)和核膜有Bcl-2蛋白陽性表達,且陽性細胞多散在分布(見圖6)。 圖1 空白組Fas表達 圖2 桂枝茯苓膠囊組Fas表達 圖3 空白組Fas-L表達 圖4 桂枝茯苓膠囊組Fas-L表達 圖5 空白組bcl-2表達 圖6 桂枝茯苓膠囊組bcl-2表達 3.3對人宮頸癌細胞Hela Caspase-3的表達? DAB在硝酸纖維素膜上顯色后,100L和300L桂枝茯苓組都有棕褐色條帶,且300L桂枝茯苓組Caspase-3的條帶比100L桂枝茯苓組條帶淡,見圖7。?

14、M:32KD Caspase-3;1:預(yù)染Mark;2:100L桂枝茯苓膠囊; 3:300L桂枝茯苓膠囊;4:300L桂枝茯苓膠囊 圖7western-blot檢測Hela細胞capase-3條帶 對人宮頸癌細胞Hela Caspase-3的表達PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,約400bp處見到條帶,與設(shè)計引物相符,300L桂枝茯苓膠囊藥液比150L和100L桂枝茯苓膠囊藥液條條帶要亮?？瞻讓φ战MmRNA的表達量明顯少于以上各組。結(jié)果見圖8。 M:400bp Caspase-3 mRNA;1:桂枝茯苓膠囊300L組; 2:桂枝茯苓膠囊300L組;3:桂枝茯苓膠囊150L l組; 4:桂枝茯苓膠囊

15、150L組;5:桂枝茯苓膠囊100L組; 6:桂枝茯苓膠囊100L組;7:空白對照組 圖8 RT-PCR檢測桂枝茯苓膠囊對人宮頸癌細胞Hela Caspase-3的表達 3.4 DNA-Ladder? 桂枝茯苓膠囊兩個劑量組處理36h后,電泳凝膠處理系統(tǒng)中出現(xiàn)DNA梯帶,見圖9。 圖9 DNA-Ladder檢測Hela細胞DNA 凋亡條帶 4 討 論? 腫瘤的發(fā)生是由于細胞增殖和凋亡失調(diào)而導(dǎo)致細胞無限增殖所致。腫瘤細胞凋亡及其增殖抑制成為評估抗癌藥物作用能力的重要指標5 。? 細胞凋亡過程受到一系列相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和控制6。目前發(fā)現(xiàn)與細胞凋亡有關(guān)的基因包括Fas、Fas-L、Bcl-2、p53、

16、 Bax、Cmy-c、等7。Fas位于細胞膜上,屬于TNF受體家族成員,Fas配體與表達Fas的細胞結(jié)合即可導(dǎo)致細胞凋亡,以抗Fas抗體與之交聯(lián),即可導(dǎo)致典型的細胞凋亡8。Bcl-2是凋亡抑制基因,以同源或異源二聚體的形式調(diào)節(jié)細胞凋亡。細胞凋亡時,內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活,        該酶切開DNA的核小體連接區(qū),形成若干180200bp大小或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段,瓊脂糖凝膠電泳時,呈現(xiàn)“階梯狀電泳條帶”(即DNA ladder),作為判斷凋亡的客觀指標之一9 。 半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)是細胞凋亡

17、的效應(yīng)蛋白,caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡的執(zhí)行者,它廣泛分布于各種類型的細胞中。caspase-3在細胞中以無活性的酶原形式存在,激活后列解成有活性的分子量17KD和12KD的亞單位10-11。因此通過測定caspase-3的活性推斷藥物的抗腫瘤作用,本實驗western-blot發(fā)現(xiàn)300L桂枝茯苓組caspase-3的條帶比100L桂枝茯苓組條帶淡,說明隨著藥物濃度增加,caspase-3被激活的量增加,這和RT-PCR結(jié)果caspase-3 mRNA300L桂枝茯苓組比100L桂枝茯苓組條帶亮一致。? 本實驗桂枝茯苓膠囊具有體外抑制Hela細胞生長作用,我們推測這

18、種作用是通過啟動細胞凋亡來達到抗腫瘤的目的。 參考文獻 1 Rao PH,Arias - Pulido H, Lu XY, et al . Chromosomal amplitications, 3q gain and deletions of 2q33-q37 are the frequennt genetic changes in cervical carcinomaJ. BMC Cancer, 2004,4 (1) : 5. 2 呂蘇成, 曹瑪莉, 曹巧莉. 茯苓多糖對肺癌患者細胞免疫功能及臨床療效的觀查J. 上海免疫學(xué)雜志, 2001(2):25. 3 吳迪. 茯苓多糖抗腫瘤作用與機理的實驗研究J. 中國藥理學(xué)通報,19