高效液相色譜法

1、0512高效液相色譜法高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。1.對儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內(nèi)徑一般為3.94.6mm，填充劑粒徑為310m。超高液相色譜儀：是適應小粒徑（約2m）填充劑的耐超高壓、小進樣量、低死體積、高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。（1） 色譜柱反相色譜柱：以鍵和非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、

2、聚合物復合硅膠和聚合物等；常用的填充劑優(yōu)十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反向色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內(nèi)徑和長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、載體表面基團殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的色譜柱。溫度會影響分離效果，品

3、種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當提高色譜柱的溫度，但一般不宜超過60。殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱，流動相的pH值一般應在28之間。殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛pH值的流動相，適合于pH值小于2或大于8的流動相。（2）檢測器最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與被測物質(zhì)的量有關，還與其結(jié)構有關；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器

4、為通用型檢測器，對所有物質(zhì)均有響應，結(jié)構相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測器的響應值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與被測物質(zhì)的量在一定范圍內(nèi)呈線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應值與被測物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關系，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應符合紫外可見分光光度法（通則0401）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器不得使用含不揮發(fā)性鹽的流動相。（3）流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相常用甲醇水系統(tǒng)和乙腈水系統(tǒng)，用紫

5、外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統(tǒng)，流動相中應盡可能不用緩沖鹽，如需用時，應盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般不低于5%，否則導致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動相：常用兩種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。品種正文項下規(guī)定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當改變，以達到系統(tǒng)適應性試驗的要求。調(diào)整流動相組分比例時，當小比例組分的百分比例X小于等于33%時，允許改變范圍為0.7X1.3X；當X大于33%時，允許改

6、變范圍為X-10%X+10%。若需使用小粒徑（約2m）填充劑，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應作適當?shù)恼{(diào)整。當對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準。當必須使用特定牌號的色譜柱方能滿足分離要求時，可在該品種正文項下注明。2.系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗：通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個參數(shù)。色譜系統(tǒng)的適用性試驗定義：按各品種正文項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行適當調(diào)整，以符合要求。（1）色譜柱的

7、理論板數(shù)（n）用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質(zhì)，一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內(nèi)標物質(zhì)色譜峰的保留時間tR和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按下式計算色譜柱的理論板數(shù)：n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2tR、W、Wh/2可用時間或長度計（下同），但應取相同單位。（2）分離度（R）用于評價待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質(zhì)與已

8、知雜質(zhì)的分離度，對色譜系統(tǒng)分離效能進行評價與與調(diào)整。也可以通過測定待測物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分離度，無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為：式中tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬（如圖）。當對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結(jié)果為準。（3）靈敏度用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力

9、，通常以信噪比（S/N）來表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定時，信噪比應不小于10；定性測定時，信噪比應不小于3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。（4）拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。拖尾因子計算公式為：式中W0.05h為5%峰高處的峰寬；d1為峰頂在5%峰高處橫坐標平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的距離（如圖）。以峰高作定量參數(shù)時，除另有規(guī)定外，T值應在0.951.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積分，但嚴重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準性，此時應在各品種正文項下對拖

10、尾因子作出規(guī)定。（5）重復性用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%；采用內(nèi)標法時，通常配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其相對標準偏差應不大于2.0%。3.測定法（1）內(nèi)標法 按各品種正文項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，各精密量取適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進樣，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：式

11、中AS為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；cS為內(nèi)標物質(zhì)的濃度； cR為對照品的濃度。再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，進樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：式中AX為供試品的峰面積或峰高；cX為供試品的濃度；As為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；cS為內(nèi)標物質(zhì)的濃度；f為內(nèi)標法校正因子。采用內(nèi)標法，可避免因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。（2）外標法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，進樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積（或峰高），按下式計算含量：式中各

12、符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定時，以手動進樣器定量環(huán)或自動進樣器進樣為宜。（3）加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取待測物質(zhì)對照品和參比物質(zhì)對照品各適量，配制待測物校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按下式計算待測物的校正因子：式中cA為待測物的濃度； AA為待測物的峰面積或峰高； cB為參比物質(zhì)的濃度；AB為參比物質(zhì)的峰面積或峰高。也可精密稱（量）取主成分對照品和雜質(zhì)對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進樣，記錄色譜圖，繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對其峰面積的回歸曲線，

13、以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計算校正因子。校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當?shù)娜芤海鳛閷φ杖芤?；進樣，記錄色譜圖，必要時，調(diào)節(jié)縱坐標范圍（以噪聲水平可接受為限）使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%25%。除另有規(guī)定外，通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質(zhì)含量。（4）不加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，若無法獲得待測物質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液、進樣調(diào)節(jié)縱坐標范圍和計算峰面積的相對標準偏差后，