濃香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析

1、基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071585。收稿日期:2011-03-02作者簡介:施思(1986-,女,在讀碩士,研究方向:食品生物技術(shù)。通訊作者:張文學(xué),男,教授,博導(dǎo),研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:foodbiotech 。濃香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析施思1,王海英1,張文學(xué)1,鄧宇2,賴登燡3,范鏖3(1.四川大學(xué)食品工程系,四川成都610065;2.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所,四川成都610041;3.四川水井坊股份有限公司,四川成都610041摘要:窖泥是發(fā)酵過程微生物棲息的生態(tài)環(huán)境之一,不同窖泥中的微生物種群隨窖泥生產(chǎn)利用年份和環(huán)境不同而呈現(xiàn)不同的多樣性。本研究

2、利用細(xì)菌16S rDNA 的V7V8區(qū)和產(chǎn)甲烷古菌16S rDNA V3區(qū)的PCR -DGGE 技術(shù),分析了不同窖泥的微生物群落特征;同時(shí)進(jìn)行了部分細(xì)菌16S rDNA 的V7V8區(qū)的序列測定。結(jié)果表明,不同窖齡及不同顏色的窖泥表征出特異性的細(xì)菌與產(chǎn)甲烷古菌群落發(fā)育狀況;UPGAMA 聚類分析顯示50年和150年黑色窖泥的菌群結(jié)構(gòu)最為相似;序列分析表明DGGE 圖譜中部分條帶的基因序列與基因庫相似菌的相似性在82%99%之間,其中梭菌屬和未被鑒定的細(xì)菌是這些窖泥樣品的優(yōu)勢菌。關(guān)鍵詞:微生物;窖泥;細(xì)菌;產(chǎn)甲烷古菌;DGGE 中圖分類號:Q93-3;TS262.31;TS261.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

3、文章編號:1001-9286(201105-0038-04Analysis of Microbial Communities Characteristics in DifferentPit Mud of Luzhou-flavor LiquorSHI Si 1,WANG Haiying 1,ZHANG Wenxue 1,DENG Yu 2,LAI Dengyi 3and FAN Ao 3(1.Food Engineering Department of Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610065;2.Biogas Research Institute,M

4、inistry of Agriculture,Chengdu,Sichuan 610041;3.Sichuan Shuijingfang Liquor Co.Ltd.,Chengdu,Sichuan 610041,ChinaAbstract :Pit mud is one of the habitats for microbes in the fermentation.Microbial populations in different pit mud present different characteris-tics due to the difference in use age and

5、 environments.In this study,PCR-DGGE of V7-V8regions of bacteria 16S rDNA and V3region of methanogenic archaeal 16S rDNA was employed to analyze microbial communities features in different pit mud and to finish sequencing V7-V8regions of some bacteria.The results showed that pit mud of different age

6、 and color would induce specific communities development of bacteria and methanogenic archaea.UPGAMA cluster analysis showed that the communities structure of black pit mud with its age of 50years and of 150years had the highest similarity.Sequencing analysis indicated that a part of gene sequences

7、in DGGE showed similarity in a range of 82%99%with that in gene database.And clostridium and the unidentified bacteria were dominant bacteria in these pit mud samples.Key words :microbe;pit mud;bacteria;methanogenic archaea;DGGE窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)中扮演了極其重要的角色。窖泥常年處于低pH 、高水分、高靜壓、兼性厭氧的窖池中,加之釀酒發(fā)酵過程的周期性開窖和閉窖,以及酒醅

8、中營養(yǎng)成分、菌群與窖泥中營養(yǎng)成分、菌群的相互作用和相互交換等作用,給窖泥微生物的生長、優(yōu)化提供了特殊的棲息環(huán)境。隨著窖池使用年份的延長,窖泥逐漸趨于老熟或老化,從而左右著傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)質(zhì)量和風(fēng)格的穩(wěn)定性。盡管老熟窖泥被看作濃香白酒生產(chǎn)的命根子,但在窖泥質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)上,一些學(xué)者已從窖泥外觀及理化指標(biāo)上作過一些探討,但尚不全面1-2;微生物研究多局限于芽孢桿菌、產(chǎn)甲烷菌、己酸菌、丁酸菌等菌種的馴化培養(yǎng)研究報(bào)道,未見對窖泥質(zhì)量判斷有指針性意義的微生物檢測指標(biāo)3-4。同時(shí),借助常規(guī)微生物分離培養(yǎng)和分類鑒定方法,對窖泥微生物的菌群構(gòu)成、分布及功能性的系統(tǒng)探討,顯得收效甚微。以前的研究者通過化學(xué)分析及傳統(tǒng)

9、微生物學(xué)方法探討過窖泥微生態(tài)的一些特征與基酒質(zhì)量的關(guān)系,普遍認(rèn)為窖泥隨著窖齡的增加會(huì)逐漸變好,但研究對象多限于小于50年的低齡窖泥5-6。由于發(fā)酵過程中黃水的下滲作用,窖底泥相對于窖壁泥受發(fā)酵過程的影響更全面,因而本課題選取了20年、50年以及有著明顯顏色差異的2口百年老窖的窖底泥進(jìn)行微生物群落特征研究,利用注:圖1為窖底泥細(xì)菌16S rDNA V7V8區(qū)DGGE 結(jié)構(gòu)圖譜。圖1細(xì)菌特異性PCR -DGGE 圖PCR -DGGE 技術(shù)及生物信息軟件分析了細(xì)菌及古菌群落的特征與分布,希望補(bǔ)充和開辟窖泥微生態(tài)研究新內(nèi)容。一方面,可以了解窖泥微生物菌群的基本構(gòu)成及豐度變化趨勢,弄清濃香型白酒發(fā)酵窖泥

10、微生物多樣性的構(gòu)成差異與不同窖齡及不同質(zhì)量性狀窖泥的相關(guān)關(guān)系;另一方面,研究結(jié)果可為窖泥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的探討提供一些參考數(shù)據(jù)和新的思路。希望通過拋磚引玉,為提升中國傳統(tǒng)白酒學(xué)術(shù)研究水平,繼承和發(fā)展中國傳統(tǒng)白酒的發(fā)酵工藝,提高中國傳統(tǒng)白酒優(yōu)質(zhì)酒生產(chǎn)能力等起到積極的推動(dòng)作用。1材料與方法1.1窖泥樣品全興水井坊優(yōu)質(zhì)窖泥,分別為窖齡20年的黑色窖底泥、50年黑色窖底泥、150年黑色窖底泥以及150年窖池淺黃色窖底泥。取樣后冷凍封存,盡快提取總DNA 。1.2主要試劑引物WBCA1、WBAC2-GC ;SAf 、PARCH519r (上海生工、2×Taq PCR MasterMix (北京天根、D

11、GGE 相關(guān)試劑均為進(jìn)口。1.3總DNA 提取及PCR 擴(kuò)增窖泥總DNA 的提取參考文獻(xiàn)7。細(xì)菌的擴(kuò)增區(qū)為16S rDNA V7V8區(qū),長度為366bp ,引物及相關(guān)擴(kuò)增過程參考文獻(xiàn)8。產(chǎn)甲烷古菌特異性擴(kuò)增區(qū)為16S rD-NA V3區(qū),長度為157bp ,引物及擴(kuò)增過程參考文獻(xiàn)9。1.4PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳及分析PCR 擴(kuò)增片段通過DGGE (Bio -Rad ,USA分析研究微生物群落。丙烯酰胺凝膠濃度為8%,變性梯度范圍為30%60%(100%變性劑為7mol/L 尿素和40%去離子甲酰胺,PCR 產(chǎn)物上樣量為50L 。在200V 、60條件下電泳240min 。電泳完畢用SY

12、BR green I (1×TAE ,110000染色45min ,通過紫外成像系統(tǒng)捕獲圖像。最后利用分析軟件(Quantity One4.2.3,Bio -Rad ,USA讀取圖譜上條帶的光密度值。完成match 比對,聚類分析采用未加權(quán)算術(shù)平均組對法(Unweighted pair group with mathematical averages,UPGAMA。1.5DGGE 圖譜中主要條帶的測序比對DGGE 條帶回收步驟參考文獻(xiàn)10?；厥誅NA 經(jīng)二次PCR 后直接送交上海生工測序。目的序列向日本DDBJ 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行提交。2結(jié)果與分析2.1細(xì)菌16S rDNA V7V8區(qū)的PC

13、R 擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE細(xì)菌特異性PCR -DGGE 圖譜及其聚類樹狀圖見圖1和圖2。應(yīng)用Quantity One 軟件共檢測到23個(gè)條帶類型。從圖1和圖2整體來看,4個(gè)樣品既有共有的條帶類型(如band1,也有各自特異性的條帶,如50年窖底泥(泳道2中的band3,150年黑色窖底泥(泳道3中band6。泳道2(50年窖底泥的細(xì)菌菌群多樣性最為豐富,其次為泳道3(150年黑色窖底泥。兩者菌群結(jié)構(gòu)相似度最高,在聚類分析中聚為一簇。band2、band4、band5、band7和band8所代表的菌群是50年及150年黑色窖底泥中相同的優(yōu)勢菌群。泳道4(150年黃色窖底泥的條帶較為單一,細(xì)菌菌群結(jié)

14、構(gòu)比較簡單,與其他3個(gè)黑色窖泥樣品的相似性距離最遠(yuǎn)。如按每種條帶類型代表一個(gè)菌屬或菌種考慮,那DGGE 的結(jié)果表明,窖泥窖齡的改變以及人工養(yǎng)護(hù)等因素可以形成特異性的細(xì)菌菌群發(fā)育及菌群分布。隨著窖齡的增長及顏色由黃變黑過程的進(jìn)行,細(xì)菌菌群逐漸豐富,優(yōu)勢菌群逐漸穩(wěn)定,在窖齡越高的窖泥如百年老窖中,細(xì)菌活性會(huì)慢慢降低,但在優(yōu)良的窖池窖泥養(yǎng)護(hù)下,其優(yōu)勢菌群以及細(xì)菌菌群豐度仍可維注:圖2為樣品系統(tǒng)發(fā)育圖(1、20年;2、50年;3、150年黑色;4、150年淺黃色。圖2細(xì)菌特異性聚類樹狀圖持正常的老熟特征。2.2細(xì)菌16S rDNA V7V8區(qū)DGGE主要條帶測序結(jié)果序列結(jié)果經(jīng)BLAST比對后,獲取的系

15、統(tǒng)發(fā)育信息見表1。條帶1對應(yīng)的菌株為4個(gè)樣品共有,推測是Clostridium下的1個(gè)新種。一般認(rèn)為,Clostridium包括一些難于或不能培養(yǎng)的丁酸菌、己酸菌等,在窖泥中與甲烷菌共生,與丁酸乙酯和己酸乙酯有關(guān)11。條帶2代表的為Petrimonas菌屬,是50年與150年黑色窖泥中所特有的一類菌群,一般為嗜溫的專性厭氧發(fā)酵細(xì)菌。條帶3所代表菌群為50年黑色窖底泥所特有的,應(yīng)該也是梭菌屬(Clostridium下的一類細(xì)菌,似乎可以根據(jù)其特異性備選為50年左右窖泥樣品的特征指示菌。條帶4和條帶8光密度值較高,應(yīng)該是50年與150年黑色窖泥所共有的一類較為優(yōu)勢的菌群。所對應(yīng)的菌群分別是分類信息

16、比較缺乏的未能培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium以及放線細(xì)菌屬(actinobacterium下的一類細(xì)菌。條帶8對應(yīng)的菌群在其他四川濃香型白酒糟醅中有過檢測報(bào)道,這也可以間接說明密閉窖池發(fā)酵過程中,各微生物區(qū)系進(jìn)行著菌群相互遷移及交替演化的動(dòng)態(tài)平衡過程。條帶6和條帶7與已知菌株相似度較低,分類信息缺乏,因此它們代表的是窖泥中的一類未知菌群。條帶5代表的是Fir-micutes細(xì)菌目,芽孢桿菌屬(Bacillus為其代表屬,一般常分離于濃香型大曲中,是其優(yōu)勢菌。2.3產(chǎn)甲烷古菌16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE產(chǎn)甲烷古菌特異性PCR-DGGE圖譜及其聚類樹狀圖

17、見圖3和圖4。同細(xì)菌菌群分析結(jié)果相似,窖泥窖齡的改變以及人工養(yǎng)護(hù)等因素同樣可以形成特異性的產(chǎn)甲烷古菌菌群發(fā)育及菌群分布。從圖3DGGE圖譜中可以看出,20年窖底泥中產(chǎn)甲烷古菌菌群含量極少,幾乎沒有檢測。另外3個(gè)樣品具有共同的產(chǎn)甲烷古菌菌群,但50年和150年黑色窖泥中古菌菌群結(jié)構(gòu)較為接近,并且多樣性十分豐富,在樣品聚類分析中同對應(yīng)的細(xì)菌菌群一樣聚為一簇。這種結(jié)果表明不同窖底泥中存在的古菌菌群演替特征與相應(yīng)細(xì)菌菌群演替特征極為類似,說明窖底泥中細(xì)菌與古菌的關(guān)系十分密切。一般認(rèn)為,這兩者之間具有互惠共生關(guān)系,典型的例子就是甲烷菌與己酸菌的共酵作用。本研究中細(xì)菌及產(chǎn)甲烷古菌菌群的分布特征再次證明了這

18、一點(diǎn)。3討論中國具有悠久的酒文化歷史,探討濃香型白酒窖池中不同性狀的窖泥與微生物菌群多樣性的關(guān)系,一方面可以了解不同窖齡的窖池中發(fā)酵活動(dòng)對微生物多樣性的影響,另一方面也可以為窖泥質(zhì)量性狀的判定及利用等提供微生物學(xué)依據(jù)。根據(jù)一般生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),典型的濃香型酒窖池中窖泥的演變規(guī)律為,隨著窖泥窖齡的增長,窖泥顏色由黃變黑至烏黑,氣味由帶有較重的硫化氫氣味到有少量酒香至濃郁酒香。這是由于釀酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸類和醇類等物質(zhì)通過黃水滲入窖底泥中,逐漸富集并越來越多地聚積相關(guān)代謝菌群,這些菌群的繁衍與代謝產(chǎn)物的積累,逐漸賦予了窖泥老熟的特征。本研究通過DGGE指紋圖譜提供了進(jìn)一步的證據(jù):在具有自然老熟特征的

19、黑注:圖3為窖底泥產(chǎn)甲烷古菌16S rDNA V3區(qū)DGGE結(jié)構(gòu)圖譜。圖3甲烷古菌DGGE結(jié)構(gòu)圖注:圖4為樣品系統(tǒng)發(fā)育圖(1、20年;2、50年;3、150年黑色;4、150年淺黃色。圖4甲烷古菌系統(tǒng)發(fā)育圖!" # $!"# $ $#$!" %& !" $ !" $ $ $ !" ( $ !" $ $窖底泥對下層糟醅產(chǎn)香的影響的研究比較多,而將濃香型酒的老窖泥或者人工窖泥用作醬香型酒窖底的窖泥,以提高產(chǎn)香效果,使窖底香與醬香結(jié)合,成為一種復(fù)合香,也值得研究和探討的。特別感謝:曾藺,師遠(yuǎn)均提供實(shí)驗(yàn)幫助。參考文獻(xiàn):1沈怡

20、方.白酒生產(chǎn)技術(shù)大全M.北京:中國輕工業(yè)出版社,1998.2李大和.白酒釀造工教程M.北京:中國輕工業(yè)出版社,2006.3周恒剛.醬香型白酒生產(chǎn)工藝的堆積J.釀酒科技,1999(1:15-17.4唐玉明,任道群,姚萬春,等.醬香型酒糟醅堆積過程溫度和微生物區(qū)系變化及其規(guī)律性J.釀酒科技,2007(5:54-58.5劉曉光,謝和,等.醬香型風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物關(guān)系的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展J.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(2:131-134.6崔利.褐變反應(yīng)與醬香型白酒(上J.釀酒科技,2007(7:54-56.7熊子書.中國三大香型白酒的研究(二醬香·茅臺篇J.釀酒科技,2005(4:25-

21、27.8唐玉明,姚萬春,任道群,等.醬香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中糟醅的微生物分析J.釀酒科技,2007(12:50-53.9崔利.形成醬香型酒風(fēng)格質(zhì)量的關(guān)鍵工藝是“四高兩長,一大一多”J.釀酒,2007,155(5:54-56.10李長江,張洪遠(yuǎn),趙新,等.武陵酒生產(chǎn)工藝創(chuàng)新剖析J.釀酒科技,2009(1:89-91.11張守財(cái).堆積發(fā)酵對醬香型白酒風(fēng)味形成的作用及其控制J.福建輕紡,2006(11:17-18.色窖底泥中,細(xì)菌及產(chǎn)甲烷古菌菌群隨著每一次發(fā)酵的進(jìn)行,其微生物區(qū)系趨于穩(wěn)定及豐富。這種規(guī)律體現(xiàn)在50年和150年黑色窖底泥中,兩者之間的細(xì)菌及古菌微生物區(qū)系都非常龐大,擁有其他2個(gè)樣品所沒

22、有的菌群,并且相似度最高。而窖泥理化性質(zhì)的差異也能在某種程度上說明其中微生物多樣性的不同。在2口百年老窖內(nèi),通過人工養(yǎng)護(hù)加入鮮窖泥的黃色窖底泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)明顯不同于具有老熟性質(zhì)的黑色窖底泥,這也說明了窖泥化學(xué)生態(tài)特征與微生物群落多樣性之間緊密關(guān)系。另外,從DGGE圖譜分析情況來看,50年和150年黑色窖泥中細(xì)菌與古菌菌群的演替及分布特征非常相近。如果從窖泥化學(xué)特征和生物特征相互作用與影響的關(guān)系來看,初步推測50年左右可能是窖池微生態(tài)發(fā)生較大變化的一個(gè)分界線。由于窖池底部在發(fā)酵過程中長期處于低氧甚至無氧狀態(tài),因此常規(guī)微生物分離檢測其微生物區(qū)系構(gòu)成在培養(yǎng)過程中顯得較為困難。細(xì)菌16S rDN

23、A V7V8區(qū)DGGE主要條帶測序結(jié)果顯示了各窖底泥中有部分細(xì)菌菌群與已知菌株的最高相似度僅為97%,最低的僅有82%,且大多為未能或難于培養(yǎng)。因此,開發(fā)新型培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)物對功能菌的篩選純化和新型菌株的鑒定分類都具有重要意義。除此之外,通過DGGE分離得到的核酸片斷除了可以鑒定菌屬還可以設(shè)計(jì)相關(guān)菌株探針,為快速檢測樣品特征指示菌提供模板信息。綜上所述,利用PCR-DGGE技術(shù)研究窖泥環(huán)境微生物多樣性,克服了常規(guī)平板培養(yǎng)方法的一些缺點(diǎn),在分析復(fù)雜微生態(tài)演替規(guī)律的研究中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。但對于窖泥等復(fù)雜微生態(tài)的研究,其微生物的真實(shí)情況仍然有待通過引物設(shè)計(jì)、電泳技術(shù)及菌群定量分析等環(huán)節(jié)的進(jìn)一步完善來反映。因此,通過DGGE免培養(yǎng)技術(shù)對窖泥微生物群落特征進(jìn)行初步分析,定性描述菌群組成,尋求相關(guān)優(yōu)勢菌和特征指示菌,進(jìn)而通過純培養(yǎng)等研究手段獲得相關(guān)菌株,才能更好地