水和飲料中細(xì)菌總數(shù)和總大腸菌群的測(cè)定

1、水和飲料中細(xì)菌總數(shù)和總大腸菌群的測(cè)定1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1學(xué)習(xí)水樣的采取方法、了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定原理和測(cè)定意義。1.2學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。1.3學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測(cè)方法。2、 實(shí)驗(yàn)原理2.1水中細(xì)菌總數(shù)可說(shuō)明被有機(jī)物污染的程度，細(xì)菌數(shù)越多，有機(jī)物質(zhì)含量越大。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，37經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌(colony-forming unit，cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。2.2所謂大腸菌

2、群，是指在37、24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。2.3水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。濾膜法僅適用于自來(lái)水和深井水，操作簡(jiǎn)單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。多管發(fā)酵法包括：初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢式小套管。乳糖能起選擇作用，

3、因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)基內(nèi)加溴甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基由紫變黃。發(fā)酵管經(jīng)37培養(yǎng)24h，小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基渾濁，顏色改變，說(shuō)明說(shuō)中存在大腸菌群，為陽(yáng)性結(jié)果。但是，有個(gè)別其他類型的細(xì)菌此條件下可能產(chǎn)氣，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管，也不一定非大腸菌群，因其也可能延遲48小時(shí)才產(chǎn)氣，這兩種情況應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此需繼續(xù)進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)，才能確定是否為大腸菌群。48小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。平板分離伊紅美藍(lán)瓊脂平板含有伊紅和美藍(lán)染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、有金屬光澤的

4、深紫色菌落。初發(fā)酵管24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離，培養(yǎng)后，將符合大腸菌群菌落特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，只有染色為革蘭氏陰性、無(wú)芽孢桿菌的菌落，才是大腸菌群菌落。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)將以上證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的菌落，接種復(fù)發(fā)酵，其原理與初發(fā)酵相同，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽(yáng)性結(jié)果。根據(jù)確定有大腸菌群存在的初發(fā)酵管數(shù)目，查閱專用統(tǒng)計(jì)表，得出總大腸菌群指數(shù)。3、 實(shí)驗(yàn)器材3.1培養(yǎng)基普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化鈉 5g，1.6溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸餾水 1000mL，pH 7.27.4。將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉

5、加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.27.4，再加入1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有德漢氏小管的試管中，每管10mL，115滅菌20min。 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有德漢氏小管的試管中，每管5mL。 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用）蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，2伊紅（曙紅）水溶液 20mL，5美藍(lán)（亞甲藍(lán)）水溶液13mL，pH 7.27.4。3.2溶液和試劑自來(lái)水、奶茶、池塘水、革蘭氏染色液、無(wú)菌水等3.3儀器和其他用品顯微鏡、載玻片、滅菌三角

6、瓶、滅菌帶塞空瓶、滅菌移液管、滅菌試管、德漢氏小管、滅菌培養(yǎng)皿。4、 操作步驟4.1水樣的采集：自來(lái)水：先將自來(lái)水龍頭用火焰灼燒3分鐘滅菌，再開(kāi)放水龍頭使水流五分鐘后，在火焰旁打開(kāi)滅菌三角燒瓶瓶塞，接取水樣以備分析。池塘水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕觥?.1.3 奶茶：在無(wú)菌操作下，將已封閉的飲料打開(kāi)，在火焰旁用三角瓶取樣，并迅速進(jìn)行分析4.2 水樣中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè) 自來(lái)水中細(xì)菌總量的檢測(cè).1用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。共做兩個(gè)平皿。.2分別傾

7、注約15ml已溶化并冷卻到45度左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即放在平整的桌面上，做平面旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。 .3另取一滅菌培養(yǎng)皿，不加水樣，傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15ml，做空白對(duì)照。.4培養(yǎng)基凝固后，倒置于37度，培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)，即為1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)。4.2.2水樣稀釋及培養(yǎng)：4.2.2.1 按無(wú)菌操作法，將水樣按10倍稀釋法稀釋。4.2.2.2根據(jù)對(duì)水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度(奶茶選擇1：10、1：100、1：1000；池塘水選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，

8、每個(gè)稀釋度作2個(gè)重復(fù)。.3將熔化后保溫度45的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。.4待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。稀釋水樣檢測(cè)平板的菌落計(jì)數(shù)方法。.1平板菌落數(shù)的選擇：  選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘

9、2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。.2稀釋度的選擇：.2.1若只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30-300之間，則以該稀釋度乘以該稀釋倍數(shù) (表1例1)。.2.2若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)取其平均數(shù)；若比值大于2，則取其中較小的數(shù)字(表l例2、例3)。.23若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)取稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù) (表l例4)。.24若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表1例5)。.2.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落

10、數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表l例6)。表 1 計(jì)算菌落總數(shù)方法舉例列次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/（cfu/mL）備注10-110-210-31136516420-16400或1.64×104兩位以后的數(shù)字采取四舍五入的方法22760295461.637750或3.8×10432890271602.227100或2.7×1044無(wú)法計(jì)數(shù)1650513-513000或5.1×105527115-270或2.7×1026無(wú)法計(jì)數(shù)30512-30500或3.1×1044.3多管發(fā)酵法測(cè)定水中總大腸菌群自來(lái)水樣的檢測(cè).1

11、初步發(fā)酵試驗(yàn)：  在2個(gè)各裝有50mL的3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的三角瓶中(內(nèi)有倒置杜氏小管)，以無(wú)菌操作各加水樣100mL。在10支裝有5mL的3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵試管中(內(nèi)有倒置小管)，以無(wú)菌操作各加入水樣10mL。搖勻后，37培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)48h。.2平板分離：  將經(jīng)24h培養(yǎng)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48h培養(yǎng)后產(chǎn)氣產(chǎn)酸的發(fā)酵管(瓶)，分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板(EMB培養(yǎng)基)上，37培養(yǎng)18-24h。將符合下列特征菌落：呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，

12、革蘭氏染色，鏡檢。.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：  將上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的典型菌落的剩余部分接于乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落13個(gè)，37培養(yǎng)24h，如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。證實(shí)存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗(yàn)的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查表2，即得總大腸菌群。表2 總大腸菌群檢索表100ml陽(yáng)性管10ml陽(yáng)性管012備注每升水樣中總大腸菌群數(shù)03411接種水樣總量300mL（100 mL2份，10 mL10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104

13、069230奶茶、池塘水等的檢測(cè).1將奶茶水樣稀釋成10-1 、10-2，接種水樣總量11.11ml，其中10，0.1，0.01ml各一份，池塘水稀釋成10-2、10-3、10-4，接種水樣總量1.111ml，其中1，0.1，0.01,0.001ml各一份。.2分別吸取1ml各稀釋度的水樣和1ml原水樣，各注入裝有10ml乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml3倍濃度乳糖蛋白發(fā)酵液的試管（瓶）中?；靹蚝螅?7培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣繼續(xù)培養(yǎng)至48h。.3以下步驟與上述自來(lái)水檢測(cè)的平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)相同。證實(shí)有大腸菌群存在后，將奶茶水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表3，將池塘水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表4。表3 總大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中大腸菌群數(shù)備注1010.10.01-90接種水樣總量為11.11（10，1，0.1，0.01 mL各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-