目基因獲得酵母雙雜交

1、關于目的基因的獲得酵母雙雜交第一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到。一、酵母雙雜交系統(tǒng)簡介 它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關系的技術。 該技術既可用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。第二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)典文獻出處Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein

2、 interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246 二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立第三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 該系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個不同的結構域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結合結構域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結構域(AD)(activation domain) 1989年美國紐約州立大學的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。第四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2

3、022年6月 這兩個結構域各具功能，互不影響，單獨存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結構方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。第五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月目前酵母雙雜交實驗采用的系統(tǒng)有LexA 系統(tǒng)和Gal4 系統(tǒng)兩種。在LexA 系統(tǒng)中，DNA 結合域由一個完整的原核蛋白LexA 構成，轉(zhuǎn)錄激活域則由一個88 個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42 構成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄; 在Gal4 系統(tǒng)中，BD 和AD 分別由Gal4蛋白上不同的兩個結構域(1-147aa 與768-881aa)構成。第六張，PPT共六十一頁，

4、創(chuàng)作于2022年6月 兩個結構域中的BD由位于N-末端的1147位多肽構成，能識別位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。 AD由位于C-末端的768881位多肽構成。 Gal4的兩個結構域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。第七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 Fields和Song將兩個融合蛋白分別構建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4

5、的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。第八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 當兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近, 形成一個大的復合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應基因的UAS，并可與之結合； Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復合物中其他成分結合，激活UAS下游報

6、告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。第九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneXDNA-BD第十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個在結構上可以分開的、功能上也相互獨立的結構域組成。1. 結構域（Domain）合作第十一張，PPT共六十一頁

7、，創(chuàng)作于2022年6月例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應基因結合結合激活轉(zhuǎn)錄實驗發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達只要DNA binding domain（DNA-BD）與Active domain（AD）靠近就能激活轉(zhuǎn)錄。第十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 拆開 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應基因結合用重組DNA技術把GAL4的兩個Domain分開，就喪失

8、了激活效應基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄第十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 重組Domain用重組DNA技術把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。Active domain蛋白A蛋白BDNA binding domain在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結合。4. 觀察報告基因表達第十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月GAL4的BD domain與AD Domain也不能靠近，所以仍然不能啟動效應基因的轉(zhuǎn)錄。（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結合（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結合上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應基因蛋白ADNA binding domain轉(zhuǎn)錄激活d

9、omain蛋白B激活轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄表達第十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結合，導致reporter gene表達。Reporter gene表達就說明X基因產(chǎn)物與Y基因產(chǎn)物能結合。雙雜交原理第十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點: 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒 具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報告基因 酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相 互結合報道株經(jīng)改造的、含報告基因的重組質(zhì)粒的宿主細胞第十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因組中G

10、AL4基因是缺失型的 基因組中引入額外的報告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細胞的特點：通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落第十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 表達“誘餌”和“獵物”蛋白； 檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因。 做法：首先構建能表達“誘餌”和“獵物”蛋白的表達載體。該載體中可加入進行營養(yǎng)型篩選的基因。四、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略第二十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點 高敏感性。原因： 采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達； 激活結構域和結合結構域結合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，之后又與啟動子結合，此三元復合體

11、使融合蛋白各組分間結合更趨于穩(wěn)定； 通過mRNA使信號放大； 檢測的結果是基因表達產(chǎn)物的累積效應，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。第二十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點2. 真實性。檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。3. 簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。4. 廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細胞質(zhì)、細胞核及膜結合蛋白。第二十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 分析已知蛋白之間的相

12、互作用 對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 在藥物設計中的應用六、酵母雙雜交系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀第二十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1.利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能 將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDN

13、A片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。第二十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。2.利用酵母雙雜交在細胞體內(nèi)研究抗原和 抗體的相互作用第二十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3.利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白相互作

14、用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。第二十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein Linkage Map） 基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。 利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。第二十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月七、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題的

15、解決和改進措施（一） 假陽性較多（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低（三） 陰性干擾第二十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月假陽性定義：在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。（一） 假陽性較多 BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。 如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結合，則可單獨激活報告基因的表達。 AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子作用激活報告基因； AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。原因：第二十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月排除假陽性的措施 作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白

16、分別作單獨激活報告基因的鑒定。采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。報告基因整合到染色體上，可使基因表達水平穩(wěn)定。優(yōu)化3-AT(3-aminotriazole，3 - 氨基三唑 )濃度。適當增加濃度可減少假陽性。第三十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月進一步分析：這種相互作用是否會在細胞內(nèi)自然發(fā)生。有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。 一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。排除假陽性的措施第三十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月原因：由于酵母轉(zhuǎn)化效率較細菌低4個數(shù)量級，因此轉(zhuǎn)化成為

17、雙雜交技術的重要瓶頸。解決辦法：引進酵母接合型 a接合型和接合型（兩者之間可形成二倍體，但自身不能）（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低第三十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月接合型酵母細胞cDNA文庫 誘鉺蛋白基因多克隆位點DNA-BD 載體 AD 載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化a接合型酵母細胞篩選平板生長菌苔篩選平板生長菌苔同一個三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定-半乳糖苷酶部分已商品化第三十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）陰性干擾融合蛋白的表達對細胞有毒性，該怎么辦？ 應選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表

18、達，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。原因：第三十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應用， 但仍存在一些局限性。八、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項第三十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母雙雜交系統(tǒng)局限性某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。-雙雜交前刪除該部分，但應避免刪除相互作用的結構域某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達或不能準確定位到胞核內(nèi)。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核

19、內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內(nèi)無法進行。 第三十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母雙雜交系統(tǒng)局限性有時DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。4. 哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究 陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。第三十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)展：酵母單

20、雜交-用于核酸和文庫蛋白之間的研究酵母三雜交-三種不同蛋白之間的互作研究酵母的反向雜交-兩種蛋白相互作用的結構和位點。反向雙雜交系統(tǒng)和三雜交技術第三十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(一) 酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybrid system) 1993年，由Wang和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實驗體系。Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature，

21、1993，364(6433):121-126.文獻出處第三十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交系統(tǒng)原理 在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代DNA Gal4結合位點。該DNA序列在相關生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結合位點。靶DNA序列特異的結合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結構域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結合位點之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標志的報告基因的表達。第四十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交系統(tǒng)原理 理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結

22、合的結構域的蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)不僅適用于識別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復制過程的蛋白質(zhì)。第四十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交系統(tǒng)應用 確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。分離編碼結合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因。定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列。 -研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用第四十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)（reverse yeast two-hybrid system）1996年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)

23、Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320. 第四十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)（reverse yeast two-hybrid system）該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷蛋白間

24、相互作用的技術，核心在于構建一種反向篩選的報告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種毒性標志作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關的小分子物質(zhì)。第四十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 第四十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽性篩選標志His3的表達，此時野生型相互作用使宿主細胞表現(xiàn)為組氨酸營養(yǎng)缺陷型。

25、第四十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應用用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學策略來篩選作用缺陷性等位基因。 在反式作用解離分子方面的應用 在蛋白質(zhì)組研究方面的應用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行預清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設想。 第四十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母雙雜交GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫實驗流程第四十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月GAL 系統(tǒng)所用酵母菌株注：菌株AH109

26、 可利用所帶的HIS3、ADE2、MEL1 三個報道基進行篩庫。菌株Y187 可利用所帶的IacZ 報道基因來驗證兩個已知蛋白間的相互作用。菌株CG-1945 可被用于用環(huán)己酰亞胺來分離BD-bait 和AD-library 質(zhì)粒。第四十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母菌株的表型第五十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月GAL 系統(tǒng)所用各種質(zhì)粒第五十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月誘餌載體第五十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月誘餌載體序列第五十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月獵物載體第五十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月獵物載體序列第五十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗流程構建于AD 載體的cDNA 文庫的擴增構建于AD 載體的cDNA 文庫的純化pGBKT7/bait 小規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母菌AH109釣餌蛋白自身激活報道基因的活性檢測pGBKT7/bait 與pACT2 小規(guī)模共轉(zhuǎn)化酵母文庫質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化已攜帶釣餌質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與庫質(zhì)粒純化第五十