目基因獲得酵母雙雜交

1、關(guān)于目的基因的獲得酵母雙雜交第一張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到。一、酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介 它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。 該技術(shù)既可用來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來(lái)研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。第二張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)典文獻(xiàn)出處Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein

2、 interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246 二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立第三張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activation domain) 1989年美國(guó)紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。第四張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2

3、022年6月 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，單獨(dú)存在時(shí)沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來(lái)的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。第五張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目前酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)采用的系統(tǒng)有LexA 系統(tǒng)和Gal4 系統(tǒng)兩種。在LexA 系統(tǒng)中，DNA 結(jié)合域由一個(gè)完整的原核蛋白LexA 構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄激活域則由一個(gè)88 個(gè)氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42 構(gòu)成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄; 在Gal4 系統(tǒng)中，BD 和AD 分別由Gal4蛋白上不同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-147aa 與768-881aa)構(gòu)成。第六張，PPT共六十一頁(yè)，

4、創(chuàng)作于2022年6月 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的BD由位于N-末端的1147位多肽構(gòu)成，能識(shí)別位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。 AD由位于C-末端的768881位多肽構(gòu)成。 Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈。第七張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Fields和Song將兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4

5、的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。第八張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因LacZ的酵母菌株后，通過(guò)SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近, 形成一個(gè)大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合； Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報(bào)

6、告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。第九張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneXDNA-BD第十張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。1. 結(jié)構(gòu)域（Domain）合作第十一張，PPT共六十一頁(yè)

7、，創(chuàng)作于2022年6月例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因結(jié)合結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達(dá)只要DNA binding domain（DNA-BD）與Active domain（AD）靠近就能激活轉(zhuǎn)錄。第十二張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 拆開 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因結(jié)合用重組DNA技術(shù)把GAL4的兩個(gè)Domain分開，就喪失

8、了激活效應(yīng)基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄第十三張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 重組Domain用重組DNA技術(shù)把這兩個(gè)Domain分別與兩個(gè)不同的多肽連接。Active domain蛋白A蛋白BDNA binding domain在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。4. 觀察報(bào)告基因表達(dá)第十四張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月GAL4的BD domain與AD Domain也不能靠近，所以仍然不能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因蛋白ADNA binding domain轉(zhuǎn)錄激活d

9、omain蛋白B激活轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄表達(dá)第十五張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導(dǎo)致reporter gene表達(dá)。Reporter gene表達(dá)就說(shuō)明X基因產(chǎn)物與Y基因產(chǎn)物能結(jié)合。雙雜交原理第十六張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn): 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒 具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)告基因 酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白相 互結(jié)合報(bào)道株經(jīng)改造的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞第十八張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 基因組中G

10、AL4基因是缺失型的 基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn)：通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落第十九張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白； 檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因。 做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白的表達(dá)載體。該載體中可加入進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型篩選的基因。四、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略第二十張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 高敏感性。原因： 采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過(guò)量表達(dá)； 激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體

11、使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定； 通過(guò)mRNA使信號(hào)放大； 檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用。第二十一張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)2. 真實(shí)性。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無(wú)需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。3. 簡(jiǎn)潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。4. 廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。第二十二張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 分析已知蛋白之間的相

12、互作用 對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用六、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀第二十三張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能 將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫(kù)載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDN

13、A片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。第二十四張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。2.利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和 抗體的相互作用第二十五張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作

14、用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。第二十六張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein Linkage Map） 基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。 利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。第二十七張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月七、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見(jiàn)問(wèn)題的

15、解決和改進(jìn)措施（一） 假陽(yáng)性較多（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低（三） 陰性干擾第二十八張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月假陽(yáng)性定義：在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活。（一） 假陽(yáng)性較多 BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。 如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。 AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子作用激活報(bào)告基因； AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來(lái)許多假陽(yáng)性。原因：第二十九張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月排除假陽(yáng)性的措施 作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白

16、分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。報(bào)告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。優(yōu)化3-AT(3-aminotriazole，3 - 氨基三唑 )濃度。適當(dāng)增加濃度可減少假陽(yáng)性。第三十張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月進(jìn)一步分析：這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。 一些實(shí)際沒(méi)有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。排除假陽(yáng)性的措施第三十一張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原因：由于酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌低4個(gè)數(shù)量級(jí)，因此轉(zhuǎn)化成為

17、雙雜交技術(shù)的重要瓶頸。解決辦法：引進(jìn)酵母接合型 a接合型和接合型（兩者之間可形成二倍體，但自身不能）（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低第三十二張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月接合型酵母細(xì)胞cDNA文庫(kù) 誘鉺蛋白基因多克隆位點(diǎn)DNA-BD 載體 AD 載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化a接合型酵母細(xì)胞篩選平板生長(zhǎng)菌苔篩選平板生長(zhǎng)菌苔同一個(gè)三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定-半乳糖苷酶部分已商品化第三十三張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）陰性干擾融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性，該怎么辦？ 應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表

18、達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)。原因：第三十四張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應(yīng)用， 但仍存在一些局限性。八、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)第三十五張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母雙雜交系統(tǒng)局限性某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。-雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核

19、內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。 第三十六張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母雙雜交系統(tǒng)局限性有時(shí)DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。4. 哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究 陽(yáng)性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽(yáng)性結(jié)果一定要通過(guò)其它的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證。第三十七張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展：酵母單

20、雜交-用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究酵母三雜交-三種不同蛋白之間的互作研究酵母的反向雜交-兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。反向雙雜交系統(tǒng)和三雜交技術(shù)第三十八張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(一) 酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybrid system) 1993年，由Wang和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)體系。Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature，

21、1993，364(6433):121-126.文獻(xiàn)出處第三十九張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交系統(tǒng)原理 在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代DNA Gal4結(jié)合位點(diǎn)。該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過(guò)相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告基因的表達(dá)。第四十張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交系統(tǒng)原理 理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)

22、合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)不僅適用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復(fù)制過(guò)程的蛋白質(zhì)。第四十一張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用 確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。 -研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用第四十二張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)（reverse yeast two-hybrid system）1996年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)

23、Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320. 第四十三張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)（reverse yeast two-hybrid system）該系統(tǒng)是一項(xiàng)鑒定阻斷蛋白間

24、相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。第四十四張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 第四十五張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽(yáng)性篩選標(biāo)志His3的表達(dá)，此時(shí)野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。

25、第四十六張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長(zhǎng)及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來(lái)篩選作用缺陷性等位基因。 在反式作用解離分子方面的應(yīng)用 在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽(yáng)性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。 第四十七張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母雙雜交GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫(kù)實(shí)驗(yàn)流程第四十八張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月GAL 系統(tǒng)所用酵母菌株注：菌株AH109

26、 可利用所帶的HIS3、ADE2、MEL1 三個(gè)報(bào)道基進(jìn)行篩庫(kù)。菌株Y187 可利用所帶的IacZ 報(bào)道基因來(lái)驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白間的相互作用。菌株CG-1945 可被用于用環(huán)己酰亞胺來(lái)分離BD-bait 和AD-library 質(zhì)粒。第四十九張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母菌株的表型第五十張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月GAL 系統(tǒng)所用各種質(zhì)粒第五十一張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月誘餌載體第五十二張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月誘餌載體序列第五十三張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月獵物載體第五十四張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月獵物載體序列第五十五張，PPT共六十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建于AD 載體的cDNA 文庫(kù)的擴(kuò)增構(gòu)建于AD 載體的cDNA 文庫(kù)的純化pGBKT7/bait 小規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母菌AH109釣餌蛋白自身激活報(bào)道基因的活性檢測(cè)pGBKT7/bait 與pACT2 小規(guī)模共轉(zhuǎn)化酵母文庫(kù)質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化已攜帶釣餌質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與庫(kù)質(zhì)粒純化第五十