骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)假體周圍骨缺損及對(duì)假體界面骨整合的影響

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)假體周圍骨缺損及對(duì)假體界面骨整合的影響【摘要】觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)假體周圍骨缺損及對(duì)假體界面骨整合的影響。方法取新西蘭大白兔15只。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞別離、擴(kuò)增、骨向誘導(dǎo)，體外與珊瑚羥基磷灰石復(fù)合構(gòu)建組織工程骨。將動(dòng)物雙側(cè)股骨髁制作0.61.2的骨缺損，分別植入鈦合金植入體，左側(cè)植入體周圍骨缺損充填組織工程骨，右側(cè)植入體周圍僅充填珊瑚羥基磷灰石為對(duì)照組。于術(shù)后4周、8周和12周分別行X線檢查、掃描電鏡、能譜分析及脫鈣骨組織學(xué)觀察。結(jié)果X線檢查示，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周缺損區(qū)內(nèi)可見(jiàn)部分骨痂形成，與周圍骨質(zhì)分界明晰；8周可見(jiàn)大量模糊高密度骨痂影；12周缺損區(qū)已根本被高密度骨痂所填滿

2、，與周圍骨質(zhì)間分界變模糊。對(duì)照組4周、8周無(wú)明顯改變，12周僅邊緣有少量的骨痂形成；X射線能譜分析示，不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組內(nèi)a、P的百分含量增高P0.05，隨著時(shí)間的變化兩組a、P百分含量都呈增高的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組鈣/磷比值隨時(shí)間變化有逐漸升高的趨勢(shì)，8周時(shí)達(dá)頂峰，隨后又降低。組織學(xué)結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周可見(jiàn)明顯的新骨形成，但仍可見(jiàn)到未吸收的羥基磷灰石顆粒。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)骨長(zhǎng)入。結(jié)論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨性誘導(dǎo)后復(fù)合珊瑚羥基磷灰石構(gòu)建組織工程骨可修復(fù)假體周圍骨缺損，促進(jìn)假體骨界面骨整合。【關(guān)鍵詞】骨整合組織工程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞珊瑚羥基磷灰石人工關(guān)節(jié)AbstratbjetiveTinvesti

3、gatetheeffetsfbnearrstralsteells(Ss)nthebnedefetarundtheiplantandthesteintegratinfiplant-bneinterfae.ethdFifteenhealthyleanNeZealandrabbitserestudied.Ssereseparated,ulturedandinduedtsteblasts.anellusbnedefets0.61.2erereatedinbilateralfeurndyleinrabbits.Titaniuallyluns(0.31.0)ereiplantedintbthdefets.

4、Tissueengineeringbneasiplantedarundthelefttitaniuallyiplant，butnlyhydrxyapatiteeraiintheright.ThebilgialharateristisereevaluatedbyX-rayexainatin,SE,energydispersiveX-rayanalysisandhistlgistudiesat4,8,and12eekspstperatively.ResultX-rayexainatinshedthedensityfbnetissuearundtheiplantasaequalis.Theinter

5、spaebeteeniplantandbneasfilledithltsfbnetrabeulaeintheexperientalgrupat12eekspstperatively.Thedensityfbnetissueasinhgeneus,andl-densityubraexistedintheinterspaeinthentrlgrup.EnergydispersiveX-rayanalysisshedthententftheaandPintheexperientalgrupasstatistiallyhigherthanthatinthentrlgrupatdifferenttiep

6、intsP0.05iththetiegingby,thententftheaandPinbthgrupshadatendenytinreasegradually.Theyshednstatistialsignifianebeteen12and8eekspstperativelyP0.05.TheratifatPbeaehigherandreahingthepeaklevelat8eek.Histlgialstudyshedthebnedefetsarundtheiplantererepairedbyneaturebneintheleftat12eekspstperatively,hileint

7、herightnnebneasfundatanytiepint.nlusinThepundsfhydrxyapatiteeraiandsteblastsinduedbySsanrepairthebnedefetarundtheiplantandiprvethesteintegratinfiplant-bneinterfae.Keyrds：steintegratin;tissueengineering;bnearrstralsteell;ralhydrxyapatiteerai;arthrplasty人工關(guān)節(jié)置換技術(shù)被認(rèn)為是20世紀(jì)骨科最成功的治療方法之一。人工假體的出現(xiàn)解決了許多從前不能實(shí)現(xiàn)的

8、難題，但其也不是毫無(wú)瑕疵的，如感染、松動(dòng)等，其中假體無(wú)菌性松動(dòng)是導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后中遠(yuǎn)期失敗的主要原因。大量的分析研究說(shuō)明假體-骨組織界面微動(dòng)磨損是導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的一個(gè)主要因素。文獻(xiàn)報(bào)告假體材料、外表特性及周圍微環(huán)境等均可影響生物性假體周圍骨長(zhǎng)入。本文應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bnearrstralsteell，Ss)骨向誘導(dǎo)后復(fù)合珊瑚羥基磷灰石構(gòu)建組織工程骨修復(fù)假體周圍骨缺損，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)假體骨界面骨整合的影響。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57月齡安康清潔級(jí)新西蘭大白兔(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物中心，編號(hào)：SKX204057)15只，5個(gè)月月齡，體重2.52.9kg，雌雄不限，分籠、顆粒干

9、飼料喂養(yǎng)。飲用自來(lái)水。1.2材料珊瑚羥基磷灰石為顆粒狀5P10R直徑14，孔徑大小400500，空隙率30%70%，由北京意華健科貿(mào)提供。鈦合金植入體為Ti-6Al-4V，直徑3,由北京百慕高科股份提供。1.3方法1.3.1骨髓Ss的別離、培養(yǎng)與骨向誘導(dǎo)無(wú)菌條件下于兔股骨大轉(zhuǎn)子下穿刺，抽取骨髓約5l后緩慢注入含10l淋巴細(xì)胞別離液的離心管中；2500r/in離心15in,汲取界面層細(xì)胞,用D-Hanks平衡鹽溶液洗2次,2500r/in離心10in；將細(xì)胞懸液按4105/L接種于75l培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),按貼壁挑選法別離骨髓Ss。7d后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，已鋪滿瓶底的50%后按13比例傳代。取第4代骨髓S

10、s將根底培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液10-8l/L地塞米松+10l/L甘油磷酸鈉+50g/L維生素，pH7.30。置37、5%2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每3d換1次液。第12d行ALP染色、茜素紅染色及I型膠原免疫組化染色，鑒定成骨細(xì)胞。1.3.2體外組織工程骨的構(gòu)建將骨髓Ss密度調(diào)整到106/l，先加100l成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液于24孔培養(yǎng)板底，放入珊瑚羥基磷灰石顆粒，向材料外表加100l成骨細(xì)胞懸液，放置37、5%2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)2h，翻轉(zhuǎn)后另一面再加100l成骨細(xì)胞懸液，培養(yǎng)2h，參加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液蓋過(guò)材料，放置37、5%2、飽和濕度孵箱中孵育，次日改換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，孵育1周。1.3.3動(dòng)

11、物模型的建立速眠寧耳靜脈麻醉后，無(wú)菌條件下取兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，顯露股骨外髁，切去骨膜。用直徑0.6環(huán)鋸由外髁向內(nèi)髁方向制作一0.61.2的松質(zhì)骨穿通性骨缺損，植入鈦合金植入體0.31.0，周圍用組織工程骨填塞、壓實(shí)，關(guān)閉切口。同法制作右側(cè)股骨髁骨缺損，鈦合金植入體周圍僅植入珊瑚羥基磷灰石作為對(duì)照。1.4觀察指標(biāo)1.4.1一般情況：包括觀察動(dòng)物進(jìn)食、切口愈合情況。1.4.2放射學(xué)觀察：于術(shù)后4、8、12周拍攝雙膝關(guān)節(jié)正側(cè)位X線片，理解骨缺損修復(fù)、骨小梁形成情況。1.4.3掃描電鏡及能譜分析：術(shù)后4、8、12周分別處死5只動(dòng)物，取植入體及周圍骨組織，噴鍍后制成掃描電鏡標(biāo)本，采用JS-5800L

12、V型掃描電鏡，行掃描電鏡觀察及能譜分析。1.4.4組織學(xué)觀察：切取股骨髁骨標(biāo)本，用10%中性福爾馬林固定，脫鈣，樹(shù)脂包埋，切片后HE染色，普通光鏡下觀察假體周圍新生骨情況。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)以x-s表示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的組間T檢驗(yàn)，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展數(shù)據(jù)處理。2結(jié)果2.1一般觀察術(shù)后7d動(dòng)物可自由活動(dòng)，未出現(xiàn)切口紅腫、滲血滲液等情況，進(jìn)食正常。2.2X線觀察實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周缺損區(qū)內(nèi)可見(jiàn)部分骨痂形成，與周圍骨質(zhì)分界明晰；8周可見(jiàn)大量模糊高密度骨痂影；12周缺損區(qū)已根本被高密度骨痂所填滿，與周圍骨質(zhì)間分界變模糊，部分羥基磷灰石顆粒影消失，植入體位置良好，無(wú)脫落圖1。對(duì)照組4周、

13、8周無(wú)明顯改變，12周僅邊緣有少量的骨痂形成。圖1術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)側(cè)(左側(cè))成骨密度均勻，可見(jiàn)骨小梁形成，植入體位置好，對(duì)照側(cè)(右側(cè))成骨不均勻，無(wú)骨小梁圖2掃描電鏡1500術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組植入體外表空隙內(nèi)充填大量類骨質(zhì)圖312周組織學(xué)為成熟的骨組織HE染色，102.3掃描電鏡：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周植入體外表孔隙內(nèi)少量骨基質(zhì)沉積。812周可見(jiàn)明顯的無(wú)定型的骨基質(zhì)沉積圖2。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)植入體外表孔隙內(nèi)，未見(jiàn)骨基質(zhì)沉積。2.4能譜分析不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組內(nèi)鈣元素和磷元素的百分含量高，有顯著性差異P0.05；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)鈣、磷元素百分含量都呈增大趨勢(shì)，12周時(shí)鈣磷元素百分含量雖較8周

14、時(shí)有所增加，但差異無(wú)顯著性P0.05；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)鈣/磷比值隨時(shí)間變化有逐漸增大趨勢(shì)，8周時(shí)達(dá)頂峰，12周較8周時(shí)有所降低；對(duì)照組內(nèi)鈣磷比值亦呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，12周時(shí)仍無(wú)減小趨勢(shì)；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組界面均含有大量、元素表1。表1植入體外表骨組織a、Pt%與a/P比值(xsn=5組別時(shí)間aPa/P實(shí)驗(yàn)組4周2.5組織學(xué)結(jié)果術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組植入?yún)^(qū)內(nèi)可見(jiàn)少許的新生骨組織形成,中心部位亦有大量成骨細(xì)胞生長(zhǎng)。術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組在植入?yún)^(qū)內(nèi)可見(jiàn)支架材料部分吸收,遺留空間被新生骨組織取代,骨缺損根本得到修復(fù)，部分區(qū)域新骨逐漸改建成熟,在材料孔隙內(nèi)出現(xiàn)板層骨樣組織,。術(shù)后12周可見(jiàn)明顯編織骨、板層骨及骨小梁形成，但仍可見(jiàn)到未吸

15、收的羥基磷灰石顆粒圖3。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)骨長(zhǎng)入，缺損區(qū)仍為羥基磷灰石顆粒，僅邊緣有少量新生骨組織。3討論假體-骨界面結(jié)合方式有兩種學(xué)說(shuō),即骨整合及纖維性骨結(jié)合。骨整合為正常的改建骨和假體之間看不見(jiàn)軟組織，假體與骨組織直接接觸，其承受的負(fù)荷能通過(guò)這種直接接觸，持續(xù)不斷地傳遞并分散到骨組織中1。骨整合是成骨細(xì)胞首先在植入體外表黏附、叢集，然后在假體外表分泌骨基質(zhì)，啟動(dòng)植入體外表上的新骨直接生成，新骨從假體外表逐漸向骨創(chuàng)面生長(zhǎng)、延伸。假體-骨界面骨整合被認(rèn)為是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的理想狀態(tài)。影響骨整合的因素有假體材料設(shè)計(jì)、固定方式、手術(shù)技術(shù)、部分血運(yùn)、假體周圍骨組織生物活性、細(xì)胞因子、激素、藥物、微

16、量元素等等。為了增加材料與骨組織之間的結(jié)合力，增加材料外表成骨細(xì)胞的黏附、遷移及分化，促進(jìn)骨整合方法有二種：一是對(duì)假體材料進(jìn)展一定的外表修飾，如噴沙、酸蝕、激光處理、電火花加工、離子濺射技術(shù)、體外表預(yù)濕等方法。生物材料外表生物活性物質(zhì)涂層如羥基磷灰石，其作用機(jī)理是：可以改變?cè)踩塍w的外表構(gòu)造，增強(qiáng)植入體與骨的機(jī)械性結(jié)合；可以引導(dǎo)骨生長(zhǎng)，加速骨沉積于植入體外表，縮短結(jié)合時(shí)間；可以阻止植入體金屬離子釋放；涂層進(jìn)步改變植入體的機(jī)械強(qiáng)度，改善植入體的彈性模量。另一種方法是改變假體周圍骨代謝，促進(jìn)骨基質(zhì)的形成。Lan等2研究證實(shí)rhBP-2在rhbFGF和rhIGF-I的協(xié)同作用下可明顯進(jìn)步植入體周圍骨

17、整合的速率。王巖等3報(bào)告rhBP-2可促進(jìn)早期骨-假體界面的骨長(zhǎng)入。薛恩興等4報(bào)告接種自體骨髓細(xì)胞可加強(qiáng)涂碳灰石多孔鈦植入物的骨整合。李亞非等5報(bào)告用BP、紅骨髓、異體骨復(fù)合即刻修復(fù)人工關(guān)節(jié)周骨缺損，可促進(jìn)新骨形成。Breush等6實(shí)驗(yàn)證實(shí)自體移植的成骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞對(duì)生物材料的骨整合具有骨誘導(dǎo)性作用。本研究應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)后與珊瑚羥基磷灰石復(fù)合修復(fù)假體周圍骨缺損，結(jié)果說(shuō)明骨髓Ss骨向誘導(dǎo)后有促進(jìn)骨整合的作用，特別是移植后的早期，這可能與部分為成骨細(xì)胞的遷移、黏附、增殖及分化提供了有利條件有關(guān)，或引入了細(xì)胞外基質(zhì)的誘導(dǎo)活性有關(guān)。但假體周圍早期骨長(zhǎng)入是源于成骨細(xì)胞或引進(jìn)的細(xì)胞外基質(zhì)的

18、誘導(dǎo)活性，尚有待于進(jìn)一步研究。應(yīng)用電子探針X線能譜分析可測(cè)量假體周圍骨組織元素相對(duì)含量、元素比、元素組成和構(gòu)造，能較好的反響假體和宿主結(jié)合界面的元素變化7。Guglieltti等8研究說(shuō)明X線能譜分析是檢測(cè)金屬外表骨性成份的有效方法。本研究不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組內(nèi)a、P元素的百分含量高，并呈增高趨勢(shì)，812周達(dá)頂峰期，說(shuō)明骨髓Ss移植組假體周圍成骨活潑，基質(zhì)分泌增高，有利于骨整合的形成。本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡觀察示實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周植入體外表孔隙內(nèi)有少量的無(wú)定形的均質(zhì)的物質(zhì)覆蓋。812周植入體外表孔隙內(nèi)可見(jiàn)明顯的無(wú)定形的物質(zhì)覆蓋。這些物質(zhì)可能是新骨所產(chǎn)生的類骨質(zhì)，與植入體結(jié)合結(jié)實(shí)。組織工程骨組a/P比值

19、8周前逐漸增高，8周時(shí)達(dá)頂峰，而后逐漸降低，說(shuō)明假體-骨界面的骨礦顆粒是一種不定形的透明鈣鹽，8周后骨的改建逐漸變?yōu)榛顫姡?2周時(shí)a/P比值為1.67，接近完全結(jié)晶的HA。文獻(xiàn)報(bào)道材料的生物活性隨a/P比值降低而升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明8周為新骨形成階段，8周后為骨改建與骨成熟階段，與組織學(xué)觀察結(jié)果相符?？傊?，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察了組織工程骨假體界面的生物學(xué)特性，結(jié)果說(shuō)明骨髓Ss可促進(jìn)假體周圍骨形成，有利于骨整合，為進(jìn)步人工假體生存率的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1BinZ,Yingguang,YanxiangY,etal.Theevlveentfthetheryfdentaliplant-bneinterfaeJ.hinJed,2022,4:170-172.2LanJ,angZ,angY,etal.TheeffetfbinatinfrebinanthuanbnerphgenetiprtEin-2andbasifibrblastgrthfatrrinsulin-likegrthfatr-Indental