藥物動力學之體內(nèi)藥物分析 (2)課件

1、藥物動力學常見研究方法樣本時間(h)0.0830.1670.3330.51.02.03.04.0113.7209.2424.8032.0602.122212.6365.7703.1501.9470.8890.3550.1680.098334.33019.9907.2105.3201.8200.6700.4300.420423.3508.4803.9902.5201.0500.7600.7000.630544.89018.7304.8402.1801.8201.5700.7500.550 x28.80213.3385.6863.3541.5281.0950.5120.424s12.055.562

2、.241.420.470.650.230.20iv雙黃連粉針(60mg/kg)后不同時間的黃芩甙血藥濃度值(g/ml) 第三層次第二層次第一層次臨床用藥指南-臨床模型選擇與應用-藥學理論規(guī)律-數(shù)學體內(nèi)藥物分析的定義狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對人和動物血液、尿和組織等樣品進行定性定量的分析。廣義：通過體內(nèi)藥物濃度的分析，了解藥物在體內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥代動力學參數(shù)，為藥品的生產(chǎn)、臨床應用作出評價。CDUTCM在1979年的治療藥物監(jiān)護雜志創(chuàng)刊號中指出：“歷史必將證明體液中藥物濃度的定量技術(shù)是藥理學重大進展之一?！眝iviansectorCDUTCM體內(nèi)藥物分析Biopharmace

3、utical analysis體內(nèi)藥物分析方法的評價體內(nèi)藥物分析的方法設計與建立生物樣品測定前的處理方法 體內(nèi)藥物分析樣品的種類與儲存 體內(nèi)藥物分析的對象與特點 viviansectorCDUTCM1從分析物分體內(nèi)藥物分析的對象母體藥物代謝物內(nèi)源性物質(zhì)viviansectorCDUTCM體內(nèi)藥物分析的對象3從樣品的來源分人體實驗動物viviansectorCDUTCM體內(nèi)藥物分析的特點1干擾雜質(zhì)多2樣品濃度低3取樣量少4工作量大5時間短viviansectorCDUTCM樣品的種類與儲存一、生物樣品的采集 體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。vivi

4、ansectorCDUTCM血細胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細胞抗凝自然全血血液常用血樣測定血樣中平均分布于細胞內(nèi)和細胞外的藥濃viviansectorCDUTCM常用抗凝劑肝素枸櫞酸草酸鹽viviansectorCDUTCM取樣次數(shù)viviansectorCDUTCM2尿樣(urine) 目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度 特點：濃度高，易于收集,但注意應水解分離（?）濃度尿樣體積viviansectorCDUTCMAnswer 尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)OOHHOHHHHOHCOOHOH+ ROH、RCOOH、RNH2、RSHOOHHOHHHHOHCOOHO

5、R H+ROH、PHNH2、PHOHviviansectorCDUTCM注意viviansectorCDUTCM3唾液(saliva)唾液中藥濃與血濃相關(guān)收集方法： 唾液的采樣一般是在漱口后15分鐘，收集門內(nèi)自然流出或舌在口波內(nèi)攪動后流出的混合唾液，然后用2000-3000rpm離心15分鐘，小心吸取上清液，然后作進一步分離、凈化處理后即可供測定用。viviansectorCDUTCM.其它非均勻樣本處死動物后盡快取出心、肝、腎等待測組織，用生理鹽水沖洗，除去血跡，濾紙拭干，準確稱取一定重量組織塊，在冰浴中勻漿，將各組織制成10%組織勻漿。 viviansectorCDUTCM常見采樣時的冷卻

6、劑viviansectorCDUTCM常見生物樣品測定方法viviansectorCDUTCM生物樣品測定前的處理方法處理方法選擇的一般原則1藥物理化性質(zhì) pKa 親脂性 揮發(fā)性 溶解度 光譜特征 穩(wěn)定性2濃度范圍 靈敏的方法3測定的目的 (定性/定量 母體/代謝)4生物樣品的種類5樣品處理與分析方法的選擇 專一性 靈敏性viviansectorCDUTCM生物樣品測定前的處理方法預處理的目的存在形式的多樣性 （游離結(jié)合代謝物）分離濃縮至富集避免出現(xiàn)渾濁和沉淀避免與試劑起反應減少設備損傷viviansectorCDUTCM生物樣品去蛋白處理1加入與水能混溶的有機溶劑及中性鹽 甲醇 乙腈 （甲醇

7、1:2 乙腈1:1.5） (NH)2SO4 NaCl2加入酸性沉淀劑 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而，pH低于等電點viviansectorCDUTCM各種蛋白沉淀的相對效率viviansectorCDUTCM生物樣品去蛋白處理3組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解(最常用枯草菌溶素）優(yōu)點：平衡條件下進行，可避免反應和降解 可改善對蛋白結(jié)合率強的藥物的回收率 不產(chǎn)生乳化4其他 加熱 超濾 viviansectorCDUTCM生物樣品綴合物水解1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 373溶劑解 某些藥物的硫酸酯，往往加入萃取溶劑時

8、發(fā)生分解。游離藥物易于有機溶劑提取viviansectorCDUTCM生物樣品的萃取1液-液萃?。?）優(yōu)點：與雜質(zhì)分離 簡便 濃集 提取率高（2）提取率：在有機相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對生物樣品一般一次萃取也可。50%即可接受，以上較好（有了較好的重現(xiàn)性）。viviansectorCDUTCM（3）影響提取率的因素pH 堿性藥物在堿性pH 酸性酸性pH，超過pKa1-2個pH值；為了較好的重現(xiàn)性，建議使用緩沖對控制樣本pH值。提取溶劑 盡可能采用非極性溶劑（？），要求沸點低，不影響檢測，性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學反應。有時在碳氫化合物中加入醇類增加提取能力和減少容器的表面吸附。

9、viviansectorCDUTCM（）萃取方法溶劑用量一般為有機溶劑：水相1:1或1:2;萃取試管渦旋離心分層吸取上層保留待測層。viviansectorCDUTCM常用溶劑viviansectorCDUTCM乳化問題措施 輕緩振搖 含有分散度大或不溶物應過濾掉 避免在高pH條件下，從水中提取藥物 避免使用易發(fā)生乳化的溶劑 萃取劑水中加入少量NaCl破乳方法 機械法 加入少量高級脂肪醇 改變表面張力 改善混合溶劑比例，增加分散相分數(shù)viviansectorCDUTCM藥物的吸附玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷血漿? viviansectorCDUTCM液固萃取固相萃取sol

10、id phase extraction SPE針管式 抽空減壓 加壓 過濾viviansectorCDUTCM固相萃取步驟固相選擇 樣品1ml 1ml規(guī)格固相 125ml 3ml規(guī)格固相固相處理 反相C18 固定相的610倍體積甲醇洗柱，使溶劑化 610倍水緩沖服液沖洗達分離狀態(tài)上樣分離 用適當?shù)娜跞軇┫礈?洗去雜質(zhì)，通N2干燥固相洗脫待測物 改變pH或極性 viviansectorCDUTCM影響固相萃取的因素（1）流速 流速快，按觸不充分，樣品流失 回收率低 柱處理 510mlmin-1 洗脫 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）裝樣 過載 突破性試驗

11、 已知濃度樣品液 小體積上柱洗脫回收百分率 加大體積洗脫回收百分率 繪圖 當回收率下降時為過載 viviansectorCDUTCM（六）生物樣品的組分濃集（七） 衍生化處理 GC衍生化 HPLC衍生化體內(nèi)藥物分析方法的建立與評價一、分析方法靈敏度專屬性光譜法+剛開始應用較多雙波長，導數(shù)色譜法+HPLC GC免疫法+疫交叉反應，重現(xiàn)性根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實驗目的分析方法的設計依據(jù)方法的建立原始方法改進創(chuàng)新創(chuàng)立方法1做好文獻總結(jié)2充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況 pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動學參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3明確測定目的、要求目的4結(jié)合實驗室條件 設備

12、條件 預處理方法藥濃監(jiān)測藥代動力學研究母體藥物和代謝物分析方法的建立1純品進行測定 確定線性范圍、靈敏度、反應條件（pH、t、T）2空白樣品測定 確定空白樣品是否有干擾3以水代替空白樣品，加標準液后測定 了解提取率、檢測濃度 確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等4空白樣品加入標準液測定 標準曲線建立 回歸方程 回收率5實驗樣品測定 以藥物進行測定空白生物介質(zhì) + 藥物空白生物介質(zhì)(雜質(zhì))給藥后的生物樣品(有無藥物?產(chǎn)物?)考慮內(nèi)標的選擇方法學的可行性驗證評價方法學確認（評價、確證、考評） （validation）“生物樣品測定的關(guān)鍵是方法學的確證。方法學確證是整個藥代動力學研究的基礎。這是藥代動力學

13、研究有別于其它藥理毒理研究的特殊之處。所有藥代動力學研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果。在通過特異性、靈敏度、精密度、準確度、穩(wěn)定性等研究建立了檢測方法學，得到了標準曲線后，在檢測過程中還應進行方法學質(zhì)控，制備隨行標準曲線并對質(zhì)控樣品進行測定，以確保檢測方法的可靠性?！?摘自: 臨床前藥代動力學研究技術(shù)指導原則（第二稿）（草案）分析方法的評價可行性和可靠性 1準確度 accuracy 測定結(jié)果與真實性的差異 用回收率表示 接近100% 相對恒定也稱萃取回收率、提取回收率 測定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標準液考慮3個濃度（高、中、低） 分布在標準曲線成上、中、

14、下一般要求絕對回收率在70%一般方法HPLC內(nèi)標內(nèi)標法時注意：藥物與內(nèi)標用各自外標法測定回收率應相近，差值10%絕對回收率方法回收率藥物系列濃度+血樣標準曲線實驗方法：取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測定，與加入標準量相比，得方法回收率，測定值15%，定量限 5);應使用與待測樣品相同的生物介質(zhì);定量范圍要能覆蓋全部待測濃度;不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標準曲線時應隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點。 5線性范圍（Linear range） 標準曲線標準曲線線性范圍標準曲線的相關(guān)系數(shù)試驗報告(論文)中應提供:5. 空白生物樣品外加被試藥物(低,中,高三個濃度; n5

15、)經(jīng)標準曲線的反算(back-calculated)測定濃度標準曲線線性范圍最低和最高濃度樣品的色譜圖viviansectorCDUTCM成分名稱標準曲線（n=7）線性范圍（g/ml）相關(guān)系數(shù)r定量限（ng）檢測限（ng）1Y = + 0.13840.061-29.687r=0.999510.42Y = + 0.03120.050-24.450r= 0.99950.80.323Y= + 0.01710.062-30.300r= 0.999710.44Y= - 0.04290.170-33.100r= 0.99982.721.085Y = - 0.03070.074-14.494r=0.9990

16、1.20.48成分名稱標準曲線（n=7）相關(guān)系數(shù)r線性范圍（g/ml）蘆薈大黃素y = 90092x - 579.810.99990.019-11.875大黃酸y = 89942x + 375.330.99990.016-9.78大黃素y = 79863x - 386.770.99990.020-12.12大黃酚y = 100818x - 224300.99910.021-13.24大黃素甲醚y = 73173x - 5966.60.99940.024-5.797如何測定超出線性范圍的樣品?Range: 10200ng/ml對大于200ng/ml的樣品要進行稀釋: 500ng/ml 50ng/

17、ml10X所處理和測定的結(jié)果是否符合要求: 50ng/ml的可信限之內(nèi) (50 ng/ml )對小于10ng/ml的樣品如何處理: 10ng/ml 20ng/mlRange: 10200ng/mlx2所處理和測定的結(jié)果是否符合要求: 10ng/ml的可信限之內(nèi) (10 ng/ml )6穩(wěn)定性（stability）（1）長期貯存穩(wěn)定性-20-70（2）短期室溫穩(wěn)定性室溫放置424h（3）冷凍解凍穩(wěn)定性冷凍解凍冷凍解凍（4）貯備液穩(wěn)定性 貯備液在室溫或冷凍條件下viviansectorCDUTCM體內(nèi)藥物過程分段研究法Biopharmaceutical analysis藥物排泄的實驗方法藥物代謝的

18、實驗方法藥物分布的實驗方法 藥物吸收的實驗方法 分段研究的對象分段研究的對象viviansectorCDUTCM吸收實驗viviansectorCDUTCM消化管吸收實驗法透皮吸收實驗法鼻腔吸收實驗法其它給藥途徑吸收實驗法消化管吸收實驗法viviansectorCDUTCM體外實驗法in vitro在體實驗法in situ體內(nèi)實驗法in vivo體外實驗法in vitro部份消化管，應用廣泛缺血Ka實際值消化管中水分平衡，引起表觀分布容積的改變同系物中脂溶性小的藥物可能吸收更快？ viviansectorCDUTCMWiseman循環(huán)法viviansectorCDUTCM外翻腸囊法viviansectorCDUTCM在體連續(xù)注入法（雙向與單向）vivianse