原核表達(dá)遇到瓶頸怎么辦

我想表達(dá)碰到的第一個(gè)瓶頸預(yù)計(jì)就是為何我的外源片段插到載體里面，PCR判斷沒(méi)問(wèn)題，雙酶切也OK，但是就是不見(jiàn)表達(dá)。一般我們是怎樣判斷沒(méi)有表達(dá)呢？大多都是第一進(jìn)行SDS。在跑膠的時(shí)候必然要設(shè)比較，比較謹(jǐn)慎的電泳比較，應(yīng)當(dāng)是：Marker

，標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性比較（若是有，且打看作

Western

的話），以及空白載體（引誘）和重組載體（不引誘）2個(gè)陰性比較，再加上引誘不相同時(shí)間的表達(dá)結(jié)果。Marker用于判斷條帶大小，標(biāo)準(zhǔn)品用于判斷Western系統(tǒng)包含抗體顯色劑和操作的靠譜性，以及精準(zhǔn)判斷大?。豢瞻纵d體（引誘）負(fù)比較有助于判斷在非引誘條件下的本底表達(dá)；而重組載體（不引誘）負(fù)比較則有助于判斷引誘的見(jiàn)效以及除去引誘劑對(duì)宿主菌暗藏的攪亂，或許是劃分細(xì)菌內(nèi)源和外源表達(dá)產(chǎn)物——偷懶可不是好習(xí)慣，會(huì)影響結(jié)果判斷。注意，接種表達(dá)和接種做感覺(jué)態(tài)都近似，必然要用挑單克隆、加足量抗生素、留宿培育的新鮮菌液轉(zhuǎn)種最好，在優(yōu)選壓力下生長(zhǎng)旺盛的種子液遠(yuǎn)比經(jīng)過(guò)4℃保留的菌液要好得多，或許是因?yàn)楸４鏁r(shí)間長(zhǎng)會(huì)致使抗生素?zé)o效部分細(xì)菌拋棄質(zhì)?；蛟S其余變化。反正就是一種經(jīng)驗(yàn)做法。跑SDS的話能夠用考馬斯亮蘭染，它敏捷度在100ng左右；但是不可以夠隨著做Western了。銀染的敏捷度在～1ng；有錢(qián)還可以用SyproRed，敏捷度高還能夠夠連續(xù)做Western。WesternBlot是蛋白質(zhì)定性和半定量的最通用的技術(shù)，詳細(xì)細(xì)節(jié)可參照生物通WesternBlot技術(shù)專題，我們有詳細(xì)介紹的。在做過(guò)WesternBlot仍沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)帶，那么就要開(kāi)始進(jìn)行下一步的分析了。第一，看看載體的多克隆位點(diǎn)和片斷插入的序列，能否有因?yàn)槊盖羞B結(jié)而不測(cè)引入了轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)。有時(shí)載體幾經(jīng)多個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的周轉(zhuǎn)，頻頻插入片斷，或許是粘端相同的不相同酶切片斷之間的連結(jié)，會(huì)心外在啟動(dòng)子后邊帶入停止位點(diǎn)，特別是用到XbaI之類的酶要當(dāng)心。此后要對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行確立，確立插入的每個(gè)堿基都是正確的，沒(méi)存心外停止的狀況。還有個(gè)大家簡(jiǎn)單忽視的問(wèn)題：就是要看基因中有沒(méi)有細(xì)菌不常用的密碼子——若是有，需要考慮換表達(dá)菌株。每種菌株都有自己獨(dú)到的設(shè)計(jì)，或許是蛋白酶缺點(diǎn)，或許是重組酶缺點(diǎn)，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更堅(jiān)固，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。

不相同的載體要配合必然的菌株使用，像pET系列就必然需要有

T7RNA聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采納不相同調(diào)控機(jī)制會(huì)使用不相同的表達(dá)菌株，所以換菌株必然要認(rèn)真看過(guò)載體的調(diào)控方式再換。以Novagen為例，若是使用BL21(DE3)表達(dá)不可以夠功的話能夠換Rosetta系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET相容的質(zhì)粒供給AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以這種菌株能夠顯然改良大腸桿菌中因?yàn)楹庇忻艽a子造成的表達(dá)限制。有時(shí)不明原由的表達(dá)蛋白截短（比預(yù)期的分子量要小很多）也可能是因?yàn)楹庇忻艽a子造成的。其余一種可能是不謹(jǐn)慎的本底表達(dá)產(chǎn)物控制。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)原則性錯(cuò)誤此后，最簡(jiǎn)單、快捷的就是改變一下表達(dá)溫度、IPTG濃度。低溫、較長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)有益于蛋白堅(jiān)固、交融表達(dá)，低濃度的IPTG能夠減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害。培育基中的葡萄糖可能會(huì)控制表達(dá)。有時(shí)表達(dá)的蛋白可能比預(yù)期的有不相同，要認(rèn)真研究電泳結(jié)果。若是試一試改變條件后仍舊沒(méi)有表達(dá)，能夠試一試換不相同的培育基。除了LB外還有TB、M9等，Novagen企業(yè)還有特其余培育基銷售增補(bǔ)各種細(xì)菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)。若是還是不可以夠，考慮那么就剩下?lián)Q換載體或許表達(dá)系統(tǒng)了。在換過(guò)不相同載體，不相同菌株此后還是表達(dá)不出來(lái)的話，筆者的建議是：放棄吧。有些蛋白是用大腸桿菌沒(méi)法表達(dá)的，或許能夠試一試其余的表達(dá)系統(tǒng)。畢竟，將建立好的質(zhì)粒交給細(xì)菌后，有些事情是我們不可以夠控制的，未知的。試一試其余的表達(dá)系統(tǒng)何嘗不是一種方法。但是原核不可以夠表達(dá)，轉(zhuǎn)去做真核，也不保險(xiǎn)，這時(shí)候試一試體表面達(dá)，會(huì)更省事，因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的限制，更簡(jiǎn)單獲得結(jié)果，可能但是開(kāi)支高些，產(chǎn)量低些。能做出結(jié)果是第一需要時(shí)，這些就不可以夠計(jì)較太多。生物通將隨后介紹幾個(gè)體表面達(dá)系統(tǒng)，歡迎留神。若是你成功表達(dá)出來(lái)了，第一要恭賀你，此后你仍舊可能碰到各種各種的問(wèn)題。這個(gè)很正常，科研的道路是波折的嘛。Q1：蛋白表達(dá)出來(lái)了，但是跑SDS時(shí)大小不符？進(jìn)行SDS的時(shí)候蛋白的凈電荷會(huì)影響遷徙率。帶電量高的蛋白會(huì)聯(lián)合較少的SDS，所以阻截了蛋白的泳動(dòng)。富含脯氨酸的蛋白會(huì)在SDS膠中挪動(dòng)得特別慢。若是蛋白的等電點(diǎn)在5到9之間，而且構(gòu)成的氨基酸組分沒(méi)有顯然的偏好，那么目的蛋白遷徙率與預(yù)期相差較遠(yuǎn)就很有可能不是因?yàn)槟z電泳造成的。我們前面提到過(guò)，在很特其余狀況下罕有密碼子的問(wèn)題也會(huì)造成表達(dá)產(chǎn)物的截短。應(yīng)加以考慮。這個(gè)時(shí)候最好利用C端或許N端的標(biāo)簽進(jìn)行WesternBlot，看能否因?yàn)榈鞍妆坏鞍酌附到舛率苟鄺l目的條帶或許比預(yù)期小很多的條帶出現(xiàn)。若是除去以上要素還是沒(méi)法找出為何與預(yù)期大小相差很遠(yuǎn)，你只好苦命地重頭再來(lái)。若是蛋白酶過(guò)高能夠換個(gè)缺陷菌株試一試。Q2：蛋白不可以夠溶，怎么辦？很多外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后都是以海涵體形式存在，海涵體是一種致密、不可以夠溶的顆粒。一般狀況下，形成海涵體表達(dá)產(chǎn)率都很高，而且簡(jiǎn)單分別，獲得比較純的包含體。海涵體致密的構(gòu)造有助于防備蛋白酶對(duì)它的降解作用，若是毒性較強(qiáng)的蛋白形成海涵體也就不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生太大的損害。若是你表達(dá)蛋白的目的是為了作為抗原制備抗體，那么出現(xiàn)海涵體也不算太壞，能夠用PBS將海涵體懸浮，使用佐劑將溶液乳化后注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫。包含體的形成據(jù)分析原由之一在于表達(dá)量過(guò)高，表達(dá)產(chǎn)物來(lái)不及折疊為活性形式——多半以高表達(dá)見(jiàn)長(zhǎng)的表達(dá)系統(tǒng)都會(huì)獲得包含體產(chǎn)物。若是交融表達(dá)含有標(biāo)簽，常用的做法是將海涵體用尿素溶解后在變性的狀況下進(jìn)行純化，此后復(fù)性。復(fù)性是表達(dá)下游最傷害人的步驟，生物通此后會(huì)逐漸介紹。但是，在那以前你應(yīng)當(dāng)還要確立一下，你的蛋白真的是不可以夠溶嗎？細(xì)胞裂解能否圓滿呢？利用相差顯微鏡或許染色后對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行察看。能否還能夠夠看到圓滿的細(xì)胞？裂解后的積淀能否和以前采集細(xì)胞積淀大小相像？裂解后溶液能否看起來(lái)澄清？以上任何一種狀況出現(xiàn)都可能意味著細(xì)胞沒(méi)有被完好裂解而致使裂解上清檢測(cè)不到產(chǎn)物。若是形成了海涵體，在比較高倍的（>400×）光鏡下能夠察看到大腸桿菌中有致密的構(gòu)造。因?yàn)楹：w可能會(huì)占有細(xì)胞一半體積。Q3：必然要可溶的蛋白，你能夠怎么做？若是你希望獲得能履行功能的蛋白，那么就最好還是想方法使蛋白以可溶形式表達(dá)，海涵體復(fù)性也是一條十分波折的道路。防備海涵體形成的方法很多，比方：采納表達(dá)量不高的表達(dá)系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達(dá)的交融表達(dá)系統(tǒng)比方

pThio

，pMal

等等，對(duì)T7

ITPGT7聚合酶）進(jìn)而降低表達(dá)速度，使用基本培育基等也有助于可溶性表達(dá)。其余一個(gè)簡(jiǎn)單忽視的問(wèn)題是大腸桿菌內(nèi)復(fù)原性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致二硫鍵不可以夠正確形成，相同簡(jiǎn)單致使表達(dá)產(chǎn)物不溶，改換菌株比方Novagen的Origami系列也有助于解決這個(gè)問(wèn)題。生物通將在隨后專門(mén)介紹幾種特其余用途的大腸桿菌菌株，不如留神。一般海涵體能夠先使用平和變性劑（如：低濃度的尿素）和去污劑（如：Triton-X100）將海涵體初步?jīng)_刷，此后用8M尿素將海涵體溶解。能夠經(jīng)過(guò)透析復(fù)性、或許是在過(guò)柱的時(shí)候復(fù)性。復(fù)性條件每個(gè)蛋白都是不相同的，所以是一條需要研究行進(jìn)的道路。有人試一試當(dāng)?shù)鞍讙煸谥由系臅r(shí)候，在復(fù)原和氧化的谷胱甘肽存在的狀況下用濃度從6M到0M的鹽酸胍過(guò)柱，促進(jìn)蛋白的折疊。在蛋白從頭折疊后用咪唑洗脫。Q4：切除標(biāo)簽時(shí)引入的蛋白酶能否必然要切除？很多時(shí)候我們要用蛋白酶除掉加入的標(biāo)簽（除了NEB出有內(nèi)含肽自