研究生轉(zhuǎn)染二

真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)二一、熒光顯微鏡的工作原理二、熒光蛋白的應(yīng)用2.1熒光顯微鏡熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）

用一定波長（短波長）的光作激發(fā)光源照射被檢標(biāo)本，使標(biāo)本的熒光物質(zhì)受激發(fā)后產(chǎn)生人眼可見的熒光（長波長），再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大后用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。

熒光（fluorescence）物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)（激發(fā)態(tài)），再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。短波光物質(zhì)emission長波光excitation2.11熒光的種類自發(fā)熒光：物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光。二次熒光：物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光。自發(fā)熒光二次熒光激發(fā)光發(fā)射光2.12熒光的性質(zhì)保持固有的熒光特性。熒光波長＞激發(fā)波長（STOKES法則）。熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度。有不同程度的衰減。熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、pH值、熒光效率。2.13熒光顯微鏡的種類透射式落射式2.14熒光顯微鏡的主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡濾光器3.141透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱透射熒光顯微鏡原理

目鏡吸收濾色鏡物鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈2.142落射熒光顯微鏡的構(gòu)造落射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡標(biāo)本2.15落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

汞燈光源:

提供激發(fā)光(U、V、B、G)

激發(fā)濾色鏡:

或稱初級濾片，置于光源與標(biāo)本之間，只讓規(guī)定波長的激發(fā)光通過。nmT%BANDPASS

吸收濾色鏡:

或稱次級濾片，置于物鏡與目鏡之間,其作用是透射樣本發(fā)射的熒光，吸收未被標(biāo)本吸收轉(zhuǎn)變的剩余紫外線等雜光，以排除其對熒光的干擾，并保護(hù)眼睛。

分色鏡:

在顯微鏡光路中呈45℃角的位置，反射短波長的激發(fā)光，同時(shí)透射長波長的熒光。＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%2.15落射熒光顯微鏡各部件特性和作用2.16濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收—根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡激發(fā)濾色鏡帶寬對圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI2.17熒光色素的選擇1.熒光染料：操作快，熒光強(qiáng)。2.熒光蛋白：特異性強(qiáng)，無毒害，可持續(xù)表達(dá)。2.18注意事項(xiàng)1.接通電源，使高壓汞燈進(jìn)入預(yù)熱狀態(tài),幾分鐘后該燈便可達(dá)到穩(wěn)定工作狀態(tài)。2.開啟熒光顯微鏡后10min達(dá)到最大的效率，汞燈點(diǎn)亮15min內(nèi)不要關(guān)燈，有助于保持燈的使用壽命，一旦關(guān)燈，須等3min后才能重新開啟。2.任何時(shí)候都不能讓細(xì)胞處于干燥狀態(tài)，封片前應(yīng)將標(biāo)本玻片浸在PBS中。3.每種熒光染料，均有自己的最適、PH值，此時(shí)熒光最強(qiáng)。熒光檢測時(shí)要在一定的PH值的緩沖液中進(jìn)行。5.油鏡觀察時(shí)應(yīng)使用專門的無熒光鏡油。CCDcameraConfocal

ConfocalvsCCD細(xì)胞標(biāo)本2.19ConfocalvsCCD激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)1）激光（Laser）單色，高強(qiáng)，方向性，偏振光；2）掃描成像（Scanning）；3）共聚焦（Confocal）；4）顯微鏡（Microscope）2.191共聚焦（Confocal）1）焦平面上的點(diǎn)和針孔位置呈物像關(guān)系（共軛）；2）非焦平面上的點(diǎn)所成的像被針孔屏蔽掉；3）最大限度減少了背景模糊像的干擾PMTxy焦平面上的點(diǎn)成像光路

PMTxy焦平面以下的點(diǎn)的成像光路PMTxy焦平面以上的點(diǎn)的成像光路（植物切片，60um）2.192掃描成像掃描成像兩層含義1）單個(gè)平面由點(diǎn)掃描生成；2）Z軸掃描（光學(xué)切片，細(xì)胞CT）(0.1um)三維各層面圖像三維影像重組Confocal最佳的圖像質(zhì)量極高的靈敏度多種應(yīng)用平臺掃描時(shí)間很長昂貴的成本CCD快速成像相對便宜的價(jià)格圖像質(zhì)量不佳對快速成像是最佳選擇一、熒光蛋白（fluorescentprotein,FP）二、FP與靶序列（targetingsequence）的融合三、FP與完整目的基因的融合四、轉(zhuǎn)染后篩選2.2融合熒光蛋白在真核細(xì)胞中的熒光定位熒光蛋白1992年P(guān)rasher等成功維多利亞水母（Aequoreavictoria）克隆到綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因的cDNA。1994年Chalfie等首次實(shí)現(xiàn)在原核細(xì)胞中表達(dá)了GFP。分子量小，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性小，能在多種異源真核細(xì)胞中表達(dá)。多色突變體或新物種FP的誕生。GFP,RFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞熒光蛋白基因＋特異性靶序列Fluorescentprotein+KDELERFluorescentprotein+PTS1peroxisomeFluorescentprotein+NLSnucleusFP＋靶序列pEYFP-ERYFPN段融合calrecticulintargetingsequence。C端融合KDELERretentionsequence(Lys-Asp-Glu-Leu)

。pDsRed2-peoxiRFPC末端融合Peroxisomaltargetingsignal（PTS1）(Ser-Lys-Leu)

。pEYFP-ERpDsRed2-peoxiEndoplasmicreticulumoflivingCHOcellsdisplayedbyyellowfluorescentprotein(YFP)YFPlabelER,RFPlabelperoxisomesFP＋完整蛋