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聚合酶鏈反應(yīng)PCR.[目的]掌握聚合酶鏈反應(yīng)的原理和方法.[原理]PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR反應(yīng)分3步:①變性:通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA，②退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，⑧延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，5’→3’的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)，以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下—個(gè)循環(huán)的模板；數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2×106-7拷貝。..[實(shí)驗(yàn)步驟]一、PCR反應(yīng)體系雙蒸水18.5μl模板1μl引物10.5μl引物20.5μldNTP1μlbuffer2.5μlTaq酶1μl總體積25μlTag酶：放在寫(xiě)著“T”字小管，每管內(nèi)裝10μl模板：放在寫(xiě)著“?！弊中」芗幼詈笠粋€(gè)試劑時(shí)多吹吸幾次混勻.二、PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置94℃4min94℃30sec55℃30sec25cycles72℃30sec72℃5min.三、電泳鑒定Marker:

1μlDNA染料

2μl上樣緩沖液

9μlDNAMarker樣品:

1μlDNA染料

2μl上樣緩沖液

9μl

擴(kuò)增后DNA樣品電泳電壓:110-120V，約30分鐘DNAMarker為D2000.實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察本次實(shí)驗(yàn)?zāi)０逶?00-500bp位置本次實(shí)驗(yàn)?zāi)０鍨榇竽c

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