淺論慢性低氧高二氧化碳對小鼠大腦線粒體功能的影響

淺論慢性低氧高二氧化碳對小鼠大腦線粒體功能的影響【摘要】目的?：探討慢性低氧高二氧化碳對小鼠大腦線粒體功能的影響。方法：雄性C57BL/6小鼠30只，隨機分成2組：A組(低氧高二氧化碳組15只)和B組(正常對照組15只)。A組飼養(yǎng)于氧艙中，艙內(nèi)氧濃度為9%～11%，二氧化碳濃度為5%～6%，每天8h～每周6d，共4周，其余時間與B組一樣，生活于正常環(huán)境。測量腦組織ATP，ADP，AMP的濃度;線粒體膜電位、COXⅠ和Ⅲ活性。結(jié)果：低氧高二氧化碳組小鼠腦組織ATP，AMP濃度顯著低于正常對照組()，線粒體形態(tài)明顯改變，腦線粒體膜電位低下、COXⅠ和Ⅲ活性受到抑制()，腦組織SOD、GSH活性降低()。結(jié)論：慢性低氧高二氧化碳可導(dǎo)致小鼠大腦線粒體功能明顯異常，其機制可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】線粒體;低氧，高碳酸血癥;氧化應(yīng)激反應(yīng);小鼠

Abstract:?Objective:Toexploretheinfluenceofchronichypoxichypercapniaonthemitochon-driainthecerebrumofthemice.?Methods:?ThirtymaleC57BL/6micewererandomlydividedintotwogroups:thehypoxichypercapnia4-weekexperimentgroup(Agroup)andnormalcontrolgroup(Bgroup).Theexperimentgroupwasexposedtoanatmospherecontaining9%～11%O2and5%～6%CO28hoursaday，6daysaweekfor4weeks.TheresttimeAgrouplivedintheroomasBgroupdid.TheconcentrationofATP，ADPandAMPwasmeasuredbyHPLC.Thechangesoftheultramicrostructuresinthemitochondriaofthecerebrumwereobservedunderthetransmissionelectronmembranepotentialofthemitochondriawasobservedbytheconfocalandtheintensitywasmeasuredbyspectrophotofluorometry.TheactivityoftheCOXⅠorCOXⅢinthemitochondriaandtheSODorGSHinthetissueofthecerebrumweremeasuredbyspectrophotofluorometry，respectively.Results:?Comparedwiththenormalcontrolgroup，theconcentrationoftheATPandAMPofmicewaslowerobviously().theultramicrostructureswereabnormalandthedensityofthemembranepotentialdecreasedofthemitochondria，theactivityoftheCOXⅠorCOXⅢinthemitochondriaofthecerebrumandtheSODorGSHinthecerebrumtiussewasalsodecreasedsignificantlyrespectively().Conclusion:?Undertheconditionofexposuetochronichypoxichypercapnia，thedysfunctionofthemitochondriainthemice’scerebrummayoccur.Itsmechanismmayberelatedtothefreeradical.

Keywords:?mitochondria;hypoxia;hypercapnia;freeradical;mice

慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)發(fā)病率近年來不斷上升，每年約有250萬人死于COPD，已經(jīng)成為威脅人類生命的第5大死因[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在慢性低氧高二氧化碳條件下，實驗動物認(rèn)知功能發(fā)生損害。但是引起認(rèn)知功能障礙的病理生理機制目前尚未十分清楚，神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是慢性低氧高二氧化碳導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制之一。此外，慢性低氧高二氧化碳還可引起老鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞水腫和海馬部位細(xì)胞因子表達異常[3-5]。線粒體是“細(xì)胞能量工廠”，其主要功能是將有機物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為ATP，是有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所，對細(xì)胞的增殖、衰老、凋亡有著至關(guān)重要的作用[5-7]。本實驗采用慢性低氧高二氧化碳小鼠模型，探討慢性低氧高二氧化碳對實驗動物的大腦線粒體功能的影響。

1材料和方法

動物C57BL/6小鼠，SPF級30只，雄性，7～9月齡，約28g(溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。

動物分組及模型建立實驗動物隨機分成2組，每組15只：分為A組(低氧高二氧化碳組)和B組(正常對照組)。A組置于低氧高二氧化碳艙中(吸入氣O2濃度為9%～11%，CO2濃度為5%～6%)，每天8h每周6d，持續(xù)4周;其余時間與B組生活在同一室內(nèi)(室溫22～26℃，相對濕度50%～70%)。為了使A組動物能適應(yīng)，每次O2濃度從21%降至10%的時間控制在15～20min，CO2濃度升高至5%的時間控制在30min。B組小鼠吸入空氣，其他條件與A組相同。

取材和方法

取材及SOD，GSH測定：直接用頸椎脫臼法處死，斷頭剝離顱骨，完整取出腦組織，置于冰盤上，去除腦干和小腦，沿矢狀裂將腦組織一分為二。用腦組織勻漿測量其SOD，GSH含量(具體按照南京建成提供的說明書操作)。

腦組織線粒體的提取：采用差速離心法分離提取腦組織線粒體。取腦組織立即放入4℃新配制的分離介質(zhì)(含mol/Lsucrose、mol/LTris-Hcl、mol/LEDTA，pH)，反復(fù)清洗3次，洗凈血跡、稱重，加入少量分離介質(zhì)，將組織充分剪碎至肉糜狀，分離介質(zhì)調(diào)整至原體積3倍，用玻璃勻漿器手動勻漿，再將勻漿液調(diào)整至原體積8倍，1?000×g、4℃低溫離心10min，取上清液，7?000×g、4℃低溫離心15min，棄上清液，沉淀物加入1mL線粒體緩沖液(含mol/Lsucrose、mol/LTris-Hcl，pH)，整個提取過程均在冰浴中(0～4℃)進行。所提取的線粒體混勻后，在-80℃冰箱中保存待用，1周內(nèi)檢測。

線粒體電鏡觀察組織塊經(jīng)%戊二醛固定后，PBS清洗，鋨酸固定，再次PBS清洗，依次脫水(70%丙酮、80%丙酮、90%丙酮、100%丙酮);環(huán)氧丙烷浸透，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片機切片，常規(guī)染色，H-600型透射電鏡觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞核和線粒體超微結(jié)構(gòu)。

腦組織腺苷酸的提取斷頭后直接經(jīng)液氮冷凍，再剝離出大腦;加入mL預(yù)冷的mol/L高氯酸，用研缽冰浴中迅速勻漿;充分勻漿后，勻漿液8?000r/min，4℃低溫離心10min;取上清液，用4mol/L的KOH溶液調(diào)pH值至;8?000r/min，4℃重復(fù)離心10min;取上清液經(jīng)μm濾膜過濾，得腦組織腺苷酸溶液。

腦線粒體膜電位測定采用2μg/μL線粒體10μL，加入稀釋液C400μL，加入染色劑B15μL混勻，放置冰槽內(nèi)孵育10min，取30μL混合液至載玻片上。在激發(fā)波長590nm、散發(fā)波長610nm波段條件下，用激光共聚焦觀察反映線粒體膜電位的紅色熒光。在激發(fā)波490nm、散發(fā)波590nm條件下，用熒光分光光度計測定反映線粒體膜電位的相對熒光單位(RFU)。

線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物I、III活性的測定將提取到的各組線粒體配制成蛋白濃度為1μg/μL的線粒體懸浮液，用分光光度法檢測線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性，具體方法參照上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司提供的試劑盒說明書操作。

腦組織ATP、ADP、AMP含量測定儀器：日本島津C18ODS色譜分析柱(5μm，200mm×mm)，柱溫為16℃，檢測波長254nm，流速mL/min，平衡8min。流動相A：150mmol/LKH2PO4+150mmol/LKCl，用2mol/LKOH調(diào)pH至;流動相B：85%A相+15%乙腈;實驗當(dāng)天流動相經(jīng)μm孔徑的微孔濾膜過濾。吸取腦組織混合液20μL測定腦組織ATP，ADP，AMP含量，并計算總腺苷酸TAN(TAN=ATP+ADP+AMP)及細(xì)胞能荷EC[EC=(ATP+1/2ADP)/TAN]值。

統(tǒng)計學(xué)處理方法組間比較采用t檢驗。

2結(jié)果

大腦組織SOD、GSH活性測定見表1。

腦組織線粒體電鏡觀察A組線粒體空泡化，嵴基本消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張;細(xì)胞漿內(nèi)溶酶體、尼氏體明顯增多(見圖1);B組線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常(見圖2)。

線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性與B組比較，A組大腦線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物I、III活性均明顯降低，差異有顯著性(P?)，見表2。

線粒體膜電位測定與B組相比：A組小鼠大腦線粒體膜電位熒光染色紅光明顯減少，表明A組線粒體膜電位受到抑制(見圖3、圖4);熒光分光光度計的定量測量結(jié)果提示A組線粒體膜電位值明顯降低，差異有顯著性()，見表3。

腦組織ATP，ADP，AMP含量的測定及EC，TAN的計算兩組小鼠腦組織腺苷酸含量及EC水平比較見表4、圖5和圖6。與B組相比較：A組的ATP，AMP，TAN濃度均顯著降低，差異有顯著性(P?);兩組的EC，ADP濃度差異無顯著性。

3討論

ATP是生命活動的源泉，細(xì)胞的代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、電活動和肌肉收縮等生理過程都需要ATP提供能量。ATP產(chǎn)生不足勢必影響細(xì)胞的代謝與功能，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥等病理生理過程的主要原因之一[6-7]。線粒體是產(chǎn)生ATP主要場所，提供機體所需要能量的90%以上。本實驗發(fā)現(xiàn)，暴露于慢性低氧高二氧化碳環(huán)境可影響小鼠的線粒體的功能：低氧高二氧化碳組小鼠的ATP，AMP，TAN濃度顯著降低，表明線粒體的產(chǎn)能功能受到了明顯影響。

暴露于慢性低氧高二氧化碳環(huán)境造成實驗動物的線粒體產(chǎn)能功能障礙的原因很多：電鏡發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠腦線粒體空泡化，脊消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，提示慢性低氧高二氧化碳組的小鼠大腦線粒體形態(tài)破壞。其次，本實驗也同時發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠大腦的線粒體膜電位明顯抑制，而線粒體膜的完整及其電位正常是維持線粒體生物學(xué)功能必要條件。線粒體膜電位抑制可能同氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，線粒體內(nèi)的自由基與線粒體膜進行電子交換，導(dǎo)致膜電位改變[6-9]。第三，線粒體呼吸鏈又稱電子傳遞鏈，由四種復(fù)合物、細(xì)胞色素C和輔酶Q組成，其中線粒體COX?I和III，既是電子載體，又是遞氫體，也是線粒體呼吸鏈中對自由基損害特別敏感的部位[10-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠線粒體COX?I和III活性顯著下降，可能與自由基損傷有關(guān)。由于自由基具有獲取電子從而達到穩(wěn)定的化學(xué)狀態(tài)傾向，因此它能誘發(fā)對細(xì)胞的組成成分的損傷[12-13]。線粒體既是自由基的來源，又是自由基的作用靶點。自由基作用于線粒體DNA、線粒體膜、電子傳遞鏈、Ca2+通道等使線粒體損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠腦組織中SOD，GSH活性顯著降低。SOD，GSH是內(nèi)源性氧自由基清除劑，保護細(xì)胞免受氧化性損傷，其活性可反映機體清除氧自由基的能力，因此，SOD，GSH活性降低，是線粒體形態(tài)功能障礙的重要原因之一。

由此可見，本實驗結(jié)果，即暴露于慢性低氧高二氧化碳環(huán)境造成實驗動物大腦的線粒體功能障礙，對揭示COPD所致的認(rèn)知功能障礙的病理生理機制有著重要意義。

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