液相色譜法簡介

液相色譜法簡介氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果，而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對照定性。當(dāng)無純物質(zhì)對照時(shí)，定性鑒定就很困難，這時(shí)需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點(diǎn)可高效液相色譜法來克服。在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論與技術(shù)，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個(gè)樣品往往長達(dá)幾小時(shí)至幾十小時(shí)，因此工作效率很低。人們曾對這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時(shí)間，但是結(jié)果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因?yàn)殡S著載液（流動(dòng)相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會(huì)顯著降低。隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高，人們制成了細(xì)小（vlO?m）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達(dá)到1?10mL/min。從而使分析一個(gè)多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時(shí)間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用，70年代以業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動(dòng)化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。高效液相色譜所用基本概念：保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動(dòng)相，則速率議程H=A+B/?+C?。式中：縱向擴(kuò)散項(xiàng)（分子擴(kuò)散項(xiàng)）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴(kuò)散項(xiàng)對板高的影響可以忽略不計(jì)。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)Cue由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動(dòng)相流速u增大時(shí)，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時(shí)，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權(quán)數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質(zhì)差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動(dòng)相的選擇很重要，并且在選擇流動(dòng)相對應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：流動(dòng)相對樣品有適當(dāng)?shù)娜芙舛?，但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不與固定液互溶；流動(dòng)相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進(jìn)雜質(zhì)和組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)下降；流動(dòng)相應(yīng)與所用檢測器相匹配，不應(yīng)對組分檢測產(chǎn)生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)，還由于它的流動(dòng)相（載液）種類比氣相色譜的流動(dòng)相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動(dòng)相，從機(jī)時(shí)可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結(jié)構(gòu)提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點(diǎn)，它適于分離、分析沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機(jī)物和一些無機(jī)物，而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的75?80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機(jī)化合物以及多種無機(jī)鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠(yuǎn)不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補(bǔ)短，相輔相成。1．分離原理凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點(diǎn)表示）隨流動(dòng)相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動(dòng)相沖洗出來。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個(gè)平衡過程而較晚地被流動(dòng)相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動(dòng)相進(jìn)，稱為過濾凝膠色譜（HFC）,而用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相時(shí)，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。2．固定相凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同，分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于3.5kg/cm2或更低），主要用于含水體系的常壓凝膠色譜，半硬質(zhì)凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/cm2。適用于非水溶劑流動(dòng)相；硬質(zhì)凝膠（如多孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適于高流速下操作。3．流動(dòng)相在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動(dòng)相。常用的流動(dòng)相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。第三章高效液相色譜法第一節(jié)概述高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9?107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流第一節(jié)概述出物進(jìn)行連續(xù)檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。二、液相色譜分離原理及分類和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動(dòng)相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶第一節(jié)概述劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。三、液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動(dòng)相，而液體和第一節(jié)概述氣體的性質(zhì)不相同；此外，液相色譜所用的儀器設(shè)備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：（1）應(yīng)用范圍不同氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物第一節(jié)概述的70~80%。（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作因?yàn)椋簹庀嗌V的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動(dòng)相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。第一節(jié)概述等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。（3） 由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。（4） 液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。第一節(jié)概述綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一，目前在化學(xué)、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。第二節(jié)高效液相色譜儀高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成（圖14-2）。分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相，開泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過流通池時(shí)，檢測器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，經(jīng)過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評(píng)價(jià)柱效高低的依據(jù)。一、高壓輸液系統(tǒng)第二節(jié)高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。1?溶劑貯存器溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L,用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相。高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細(xì)，所填固定相粒度很小，因此，對流動(dòng)相的阻力較大，為了使流動(dòng)相能較快地流過第二節(jié)高效液相色譜儀色譜柱，就需要高壓泵注入流動(dòng)相。對泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動(dòng)，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。此外，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好。高壓輸液泵，按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動(dòng)相粘度和柱滲透無關(guān)。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。第二節(jié)高效液相色譜儀梯度洗脫裝置梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺(tái)泵即可。另一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設(shè)置的程序，注入梯度混合室混第二節(jié)高效液相色譜儀合，再輸至柱系統(tǒng)。梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。二、 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。第二節(jié)高效液相色譜儀三、 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm,柱長為10?50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。四、檢測器檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類型的檢測器，一類是溶質(zhì)性檢第二節(jié)高效液相色譜儀測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于此類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等；另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)。屬于此類檢測器有示差折光檢測器等。第三節(jié)高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相一、固定相高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0?108?1.0?109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5?108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相第三節(jié)高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相兩類。表面多孔型固定相它的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆第三節(jié)高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相粒很細(xì)（5?10?m）,孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。二、流動(dòng)相由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑第三節(jié)高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)到最高靈敏度。（3）高純度由于高效液相色譜靈敏度高，對流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。第三節(jié)高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相（4）化學(xué)穩(wěn)定性好（5）低粘度（粘度適中）若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。第四節(jié)液—固色譜法液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，位于其表面的原子、離子或分子的性質(zhì)是多少不同于在內(nèi)部的原子、離子或分子的性質(zhì)的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結(jié)構(gòu)而受到擾動(dòng)。因此，表層一般處于較高的能級(jí)，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行分離，故也稱為液固吸附色譜。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，第四節(jié)液—固色譜法易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對同系物沒有選擇性（即對分子量的選擇性?。?，不能用該法分離分子量不同的化合物。一、液固色譜法固定相液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。極性吸附劑可進(jìn)一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化第四節(jié)液—固色譜法鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物等。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。在現(xiàn)代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。三、液-固吸附色譜流動(dòng)相液相色譜的流動(dòng)相必須符合下列要求：（1）能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。（3）粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。第四節(jié)液—固色譜法（4）應(yīng)與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光。（5）容易精制、純化、毒性小，不易著火、價(jià)格盡量便宜在液-固色譜中，選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。第五節(jié)液液色譜法液液色譜又稱液液分配色譜。在液液色譜中，一個(gè)液相作為流動(dòng)相，而另一個(gè)液相則涂漬在很細(xì)惰性載體或硅膠上作為固定相。流動(dòng)相與固定相應(yīng)互不相溶，兩者之間應(yīng)有一明顯的分界面。分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個(gè)分液漏斗中進(jìn)行的溶劑萃取相類似。以氣液分配色譜法一樣，這種分配平衡的總結(jié)果導(dǎo)致各組分的差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離。分配系數(shù)（K）或分配比（k）小的組分，保留值小，先流出柱。然而與氣相色譜法不同的是，流動(dòng)相的種類對分配系數(shù)有較大的影響。第五節(jié)液液色譜法一、 固定相液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1） 表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為30?40?m的實(shí)心玻璃球和厚度約為1?2?m的多孔性外層所組成。（2） 全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑30?50?m的多孔型顆粒。（3） 全多孔型微粒載體，由nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5?10?m。由于顆粒小，第五節(jié)液液色譜法所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。由于液相色譜中，流動(dòng)相參與選擇作用，流動(dòng)相極性的微小變化，都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如?，??—氧二丙腈（ODPN）,聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鯊?fù)楣潭ㄒ旱?。二?流動(dòng)相在液液色譜中，除一般要求外，還要求流動(dòng)相對固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動(dòng)相的性質(zhì)往往處于兩個(gè)極端，例如當(dāng)選擇固定液是極性物質(zhì)時(shí)，所選用的流動(dòng)相第五節(jié)液液色譜法通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。以極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相的液液色譜，稱為正相分配色譜，適合于分離極性化合物；反之，如選用非極性物質(zhì)為固定相，而極性溶劑為流動(dòng)相的液液色譜稱為反相分配色譜，這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。第六節(jié)化學(xué)鍵合相色譜將固定液機(jī)械地涂漬在擔(dān)體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動(dòng)相，但在色譜過程中固定液仍會(huì)有微量溶解。以及流動(dòng)相經(jīng)過色譜柱的機(jī)械沖擊，固定相會(huì)不斷流失，即使將流動(dòng)相預(yù)先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個(gè)前置柱，使流動(dòng)相先通過前置柱，再進(jìn)入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。70年代初發(fā)展了一種新型的固定相—化學(xué)鍵合固定相。這種固定相是通過化學(xué)反應(yīng)把各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學(xué)鍵合色譜適用于分離幾第六節(jié)化合鍵合色譜法乎所有類型的化合物。根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。一、化學(xué)鍵合固定相法化學(xué)鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對硅膠進(jìn)行酸洗、中和、第六節(jié)化合鍵合色譜法干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為四種鍵型：（1） 硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相將醇與硅膠表面的羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應(yīng)生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。（2） 硅氮型（=Si-N=）鍵合相如果用SOC12將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相。第六節(jié)化合鍵合色譜法可用非極性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相。（3） 硅碳型（=Si-C=）鍵合相將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。（4） 硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。這類鍵合相具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。第六節(jié)化合鍵合色譜法二、反相鍵合相色譜法在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡稱ODS或C18）硅膠-苯基等，用強(qiáng)極性的溶劑為流動(dòng)相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機(jī)鹽的緩沖液等。目前，對于反相色譜的保留機(jī)制還沒有一致的看法，大致有兩種觀點(diǎn)：一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。分配色譜的作用機(jī)制是假設(shè)混合溶劑（水+有機(jī)溶劑）中極性弱的有機(jī)溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動(dòng)相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進(jìn)行分第六節(jié)化合鍵合色譜法配。吸附色譜的作用機(jī)制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來分離有機(jī)化合物時(shí)，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會(huì)從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分第六節(jié)化合鍵合色譜法的表面積越大，或者流動(dòng)相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，分配比也越大，保留值越大。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。三、正相鍵合色譜法在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機(jī)基團(tuán)，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團(tuán)而定。最常用的有氰基(CN)、氨基(-NH2)、二醇基(DIOL)鍵合相。流動(dòng)相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的極性第六節(jié)化合鍵合色譜法溶劑(如氯仿、醇、乙腈等)，以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離極性化合物。一般認(rèn)為正相色譜的分離機(jī)制屬于分配色譜。組分的分配比K值，隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相中極性調(diào)節(jié)劑的極性增大(或濃度增大)而降低。同時(shí)，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。該法主要用于分離異構(gòu)體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。第六節(jié)化合鍵合色譜法四、離子性鍵合相色譜法當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)化學(xué)各種離子交換基團(tuán)如-SO3H,-CH2NH2,-COOH,-CH2N(CH3)Cl等時(shí)，形成了所謂的離子性鍵合色譜。其分離原理與離子交換色譜一樣，只是填料是一種新型的離子交換劑而已?；瘜W(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)：適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以第六節(jié)化合鍵合色譜法通過改變流動(dòng)相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。(3)鍵合固定相對不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。(4)固定相柱效高，使用壽命長，分析重現(xiàn)性好。第七節(jié)離子交換色譜法離子交換色譜以離子交換樹脂為固定相，樹脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過固定相時(shí)，組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換，根據(jù)組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。一、固定相離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種形式：一是常見的純離子交換樹脂；第二種是玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹脂薄層構(gòu)成的表面層離子交換樹脂；第三種為大孔徑網(wǎng)絡(luò)型樹脂。第七節(jié)離子交換色譜法典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)共聚而成。其中，二乙烯苯起到交聯(lián)和加牢整個(gè)結(jié)構(gòu)的作用，其含量決定了樹脂交聯(lián)度的大小。交聯(lián)度一般控制在4~16%范圍內(nèi)，高度交聯(lián)的樹脂較硬而且脆，但選擇性較好。在基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上引入各種不同酸堿基團(tuán)作為可交換的離子基團(tuán)。按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂上具有與陽離子交換的基團(tuán)。陽離子交換樹脂又可分為強(qiáng)酸性和弱酸性樹脂。強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂所帶的基團(tuán)為S03-H+，其中-SO3-和有機(jī)聚合物牢固結(jié)合形成固定部分，H+是可流動(dòng)的能為其它陽離子所交換的離子。第七節(jié)離子交換色譜法陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團(tuán)。陰離子交換樹脂也可分為強(qiáng)堿性和弱堿性樹脂。二、流動(dòng)相離子交換樹脂的流動(dòng)相最常使用水緩沖溶液，有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度。第八節(jié)排阻色譜法排阻色譜法也稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法，是一種根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。排阻色譜的色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。凝膠的孔穴僅允許直徑小于孔開度的組分分子進(jìn)入，這些孔對于流動(dòng)相分子來說是相當(dāng)大的，以致流動(dòng)相分子可以自由地?cái)U(kuò)散出入。對不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內(nèi)的不同深度，大個(gè)的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內(nèi)，但進(jìn)不了小孔甚至于完全被排斥。小個(gè)的組分分子，大孔小孔都可以滲入，甚至進(jìn)入很深，一時(shí)不易洗脫出來。因此，大的組分分子在色譜柱中停留時(shí)間較短，很快被洗脫出來，它的洗脫體積很第八節(jié)排阻色譜法小，小的組分分子在色譜柱中停留時(shí)間較長，洗脫體積較大，直到所有孔內(nèi)的最小分子到達(dá)柱出口，完成按分子大小而分離的洗脫過程。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。排阻色譜的固定相一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富有彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。第八節(jié)排阻色譜法（1） 軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍。它們適用于水溶性作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜在高效液相色譜中。（2） 半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。（3） 剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等，它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。第九節(jié)色譜分離方法的選擇要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。一、相對分子質(zhì)量對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則第九節(jié)色譜分離方法的選擇可用空間排阻色譜法。二、溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。三、化學(xué)結(jié)構(gòu)若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也第九節(jié)色譜分離方法的選擇都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。色譜法基本要求掌握色譜法的分類，色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語；掌握色譜法的基本理論，了解柱效的影響因素；掌握分離度與柱效、選擇因子、容量因子、分析時(shí)間之間關(guān)系；了解定性、定量分析方法；掌握氣相色譜流程及氣相色譜儀的結(jié)構(gòu)；掌握氣相色譜固定相的特性；掌握檢測器性能指標(biāo)的描述方法；掌握液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及基本概念；了解液相色譜法的主要類型及固定相、流動(dòng)相的選擇。了解色譜方法選擇。色譜常用符號(hào)與術(shù)語表下面列出了本書中所有的符號(hào)的意義及單位。如收中已有定義式，方程序號(hào)則在說明后的括號(hào)中標(biāo)出。<<常用術(shù)語>>A：吸收度（式3.1,3.2）；也作面積CAN:乙腈（acetonitrile）B（%B）：二元流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑（％v/v）C8,C18:烷基鍵合相的鍵長度（八烷基或十八烷基）CD：環(huán)糊精（cyclodextrin）CV：變異系數(shù)（通常以％表示）；式15.3dC：色譜柱內(nèi)徑（cm）dP：顆粒直徑（?皿）DAD：二極管陣列檢測器EC：電化學(xué)（檢測器）F：流速(ml/min)FL：熒光（檢測器）GS：梯度斜度參數(shù)（式8.2a）；k*=20/GSh'：峰咼HP：惠普公司（Hewlett-Peckard）HPLC：高效液相色譜ID：內(nèi)徑，dCIEC:離子交換色譜（ion-exchangechromatography）IPC：離子對色譜（ion-pairechromatography）k：保留因子（式2.4）k*:梯度洗脫中,k的有效值或平均值（式8.1）ka，kZ：色譜圖中，首峰（a）和末峰（z）的k值L：色譜柱長度（cm）LC-MS:液相色譜-質(zhì)譜M：分子量MC：二氯甲烷（methylenechloride）MeOH：甲醇（methanol）MS:質(zhì)譜MTBE：甲基-叔-丁醚（methyl-t-butylether）N：色譜柱塔板數(shù)（式2.82.8b）N'：噪音（式3.3,圖3.3）NARP:非水反相HPLCNPC：正相色譜P：色譜柱壓力降(通常以psi表示)(式2.9)pKa：酸或供質(zhì)子堿的酸性常數(shù)PAH：多環(huán)芳烴(polyaromatichydrocarbon)RS：分離度(式2.1)RI：折光指數(shù)RPC：反相色譜S：信號(hào);式3.3;圖3.3;以及由式6.1定義的參數(shù)tD：延遲或滯留時(shí)間(min,用于梯度洗脫中);等于VD/FtG：梯度時(shí)間(min)tR：保留時(shí)間(min)(圖2.2);等于tO(1+k)tRa,tRz:色譜圖中首峰(a)與末峰(z)的保留時(shí)間，tR(min)(圖8.6a)tO：色譜柱死時(shí)間(min)(式2.5)t1,t2:相鄰譜峰1與譜峰2的保留時(shí)間(min)TEA:三乙胺(triethylamine)TEA:四氫咲喃(tetrahydrofuran)UV：紫外光譜VD：延遲或滯留體積(mL);為梯度混合器與色譜柱人口之間的體積(包括混合器的體積)Vm：色譜柱死體積(mL)(式2.6);Vm為色譜柱內(nèi)部的流動(dòng)相體積，不包括附于固定相上的溶劑Vmax:最大樣品體積(mL)(式13.1)Va：樣品體積(mL)w：重量(mg);也作半峰高處的峰寬(min)wmax:不超載色譜柱的最大進(jìn)樣量(mg)(式2.17)wS：色譜柱的飽和容量(mg)(式13.4)W：峰底寬(min)(圖2.2)Wth:大進(jìn)樣量對峰底寬的貢獻(xiàn)(min)(式13.2)WO：小進(jìn)樣量的峰底寬(min)W1/2：半峰高處的峰寬(min)(圖1.1)a：分離因子，等于k2/k1,其中k2與k1分別為相鄰譜峰2和譜峰1的k值△tR：tRz-tR(min)△%B：梯度洗脫期間,％B的變化：摩爾吸收系數(shù)o：正相HPLC中溶劑或溶劑混合液的強(qiáng)度:粘度(CP)<<不常有符號(hào)>>A,B,C：式2.11中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ),B與C隨k值而變化,但改變其它條件或溶質(zhì)時(shí)基本不變A',B',C':式2.10中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)',B'與C'隨條件和樣品而變化A",B”,C":式2.10a中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)'',B'與C''隨條件和樣品而變化C：譜峰最大值處的濃度(mol/L)CO：注入樣品中溶質(zhì)的濃度(mol/L)GI：化學(xué)電離(MS)DGA：N,N-二甲基-1-萘酰胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)EI：電子電離(MS)ELS:蒸發(fā)光散射擊(Evaporativelightscattering)EtOAc:乙酸乙酯(ethylacetate)FAB：快速原子轟擊(MS)FD：場解吸附(MS)h：折合板高，等于H/dP(式2.11)HB：羥基苯甲酸(hydrxybenzoicacid)(圖7.8,7.17與7.19)HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyricacid)IPA：異丙醇(isopropanol)kW：以水作為流動(dòng)相的k值(式6.1)LCEC:液相色譜電化學(xué)檢測器LD：激光解吸(MS)LSIMS:液態(tài)二級(jí)離子質(zhì)譜MALDI：基質(zhì)輔助激光解吸電離MP：對羥苯甲酸甲酯[P-]m:流動(dòng)相中離子對試劑P-的濃度(mmol/L)PAD：脈沖電流分析檢測器PBP：極性鍵合相PD：等離子解吸(MS)PP：對羥苯甲酸丙酯PTH：乙內(nèi)酰苯硫脲R+,R-：分別為陰離子與陽離子離子交換色譜柱中的荷電功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-S03-]RF：響應(yīng)因子TBA+：四丁基銨離子tBME：見MTBETMS:三甲基硅烷(trimethylsilyl;也為C1)TNB:1,3,5-三硝基苯(1,3,5-trinitrobenzene)TOFMS：時(shí)間飛行質(zhì)譜TSP：熱噴霧(MS)u：流動(dòng)相通過色譜柱的速度(cm/s);等于L/toV：峰底寬(mL)Vc：色譜柱內(nèi)峰展寬對V的貢獻(xiàn);也作小樣品量峰底寬(mL)(式2.16)VR：保留體積(mL)W：峰寬(min)(式2.12)Wc,WS,：分別為色譜柱，進(jìn)樣器，連續(xù)管和流通池對W的貢獻(xiàn)(min)Wlc，Wfc：(式2.12)X,X1,：無特征結(jié)構(gòu)的溶質(zhì)(圖7.8,7.17和7.19)X2,X3XB：流動(dòng)相中的B溶劑的摩爾分?jǐn)?shù)V：折合速度，等于udp/Dm(式2.11)6：高斯曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差;等于峰底的1/4:檢測器響應(yīng)時(shí)間常數(shù)(S)巾：流動(dòng)相中B溶劑的體積分?jǐn)?shù);等于0.01%B高效液相色譜儀操作步驟高效液相色譜儀操作步驟：．過濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。．對抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。.打開HPLC工作站(包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀)，連接好流動(dòng)相管道，連接檢測系統(tǒng)。.進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。.有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge,再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過10ml/min。.調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on,走基線，觀察基線的情況。.設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file,選取selectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊newmethod。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。.進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。.關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。.填寫登記本，由負(fù)責(zé)人簽字。注意事項(xiàng)：.流動(dòng)相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動(dòng)相要小心振動(dòng)盡量不引起氣泡。2）．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。3）．所有過柱子的液體均需嚴(yán)格的過濾。4）．壓力不能太大，最好不要超過2000psi。液相色譜常見問題及處理方法HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法1．樣品量不足，解決辦法為增加樣品量2．樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子3．樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器4．檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。5．檢測器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)6．檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。7．檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。8．記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9．流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。10．檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。為什么HPLC柱柱壓過高柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1．拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2．把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；3．將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；4．更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？1．篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2．存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子如何解決HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間發(fā)生漂移或急速變化漂移現(xiàn)象1．溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2．流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3．柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡快速變化現(xiàn)象流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2．泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3．流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合HPLC儀器問題1、 我的HPLC泵壓明顯的偏高，請問可能的原因？答：流速設(shè)定過高；流動(dòng)相或進(jìn)樣中有機(jī)械雜質(zhì)，造成保護(hù)柱、柱前篩板或在線過濾器阻塞；流動(dòng)相粘度過大；柱溫過低；緩沖鹽結(jié)晶；壓力傳感器故障。2、 基線不穩(wěn)，上下波動(dòng)或漂移的原因是什么，如何解決？答：a.流動(dòng)相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氦氣脫氣單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右，去處堵塞物泵密封損壞，造成壓力波動(dòng)；更換泵密封系統(tǒng)存在漏液點(diǎn)；確定漏液位置并維修流通池有臟物或雜質(zhì)；清洗流通池柱后產(chǎn)生氣泡；流通池出液口加負(fù)壓調(diào)整器檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處；將波長調(diào)整至最大吸收波長處柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)；用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對柱子進(jìn)行沖洗。3、 接頭處為何經(jīng)常漏液，如何處理？答：接頭沒有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手?jǐn)Q緊，再用專用扳手緊1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會(huì)留下死體積。接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。4、 進(jìn)樣閥漏液是如何造成的？答：a.轉(zhuǎn)子密封損壞；更換轉(zhuǎn)子密封定量環(huán)阻塞；清洗或更換定量環(huán)進(jìn)樣口密封松動(dòng)；調(diào)整松緊度進(jìn)樣針頭尺寸不合適，一般是過短；使用恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣針（注意針頭形狀）廢液管中產(chǎn)生虹吸；清空廢液管譜圖問題1、 問：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？答：a.篩板阻塞；反沖色譜柱、更換進(jìn)口篩板色譜柱塌陷；填充色譜柱有干擾物質(zhì)的存在；使用更長的色譜柱、改變流動(dòng)相或更換色譜柱流動(dòng)相PH值不合適；調(diào)整PH值，對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰樣品與填料表面的溶化點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)；加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑或更改色譜柱2、 問：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保護(hù)柱或分析柱污染；取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析。如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧Ｈ绻麊栴}仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動(dòng)相；改變樣品溶劑，如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。3、 問：K'值增加時(shí)，拖尾更嚴(yán)重，這是為什么？答：反相模式，二級(jí)保留效應(yīng)；加入三乙胺（或堿性樣品）加入乙酸（或酸性樣品）C.加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）更換一支柱子4、 問：保留時(shí)間的波動(dòng)有幾種可能的原因？答：溫控不當(dāng)；調(diào)節(jié)好柱溫。流動(dòng)相組分變化；防止流動(dòng)相蒸發(fā)、反應(yīng)等，做梯度時(shí)尤其要注意流動(dòng)相混合的均勻。色譜柱沒有平衡；在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。工作站問題1、 使用ChromStation色譜工作站時(shí)，顯示器上看不見基線，這是什么原因？答：a.連接檢測器和工作站的信號(hào)連線松落；重新擰緊線頭。信號(hào)通道是處于關(guān)閉狀態(tài)；在軟件中打開通道?；€顏色與背景色重合；調(diào)整基線顏色。工作站硬件設(shè)置被改動(dòng)；復(fù)原。2、 用ChromStation工作站，如何計(jì)算顯示性能評(píng)價(jià)參數(shù)？答：打開菜單：方法->性能評(píng)價(jià)，彈出"性能評(píng)價(jià)"對話框，填寫其中的參數(shù)，選中"計(jì)算性能參數(shù)"選項(xiàng)，確定。點(diǎn)"分析"即可。:色譜常見問題及解決辦法（色譜講座,色譜儀的日常維護(hù)）用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？色質(zhì)聯(lián)用中毛細(xì)柱的選擇應(yīng)注意什么問題？液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？從那些方面可以簡單判別毛細(xì)管柱子的熱穩(wěn)定性好壞？為什么進(jìn)樣器內(nèi)的玻璃襯套會(huì)對色譜行為造成影響？毛細(xì)管色譜分流進(jìn)樣時(shí)，非線性分流的主要原因是什么？HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？做PGS/MS分析時(shí)，如何防止焦油狀污染物進(jìn)入毛細(xì)柱？我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時(shí)柱壓過高，請問為什么？高溫毛細(xì)柱的使用壽命一般為多長？如毛細(xì)管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢復(fù)？是否可通過老化來解決？BPX70毛細(xì)柱是否可用于GC/MS分析？問:用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？<Aname="1">答:關(guān)于漂移問題：1．溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2．流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3．柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡關(guān)于快速變化問題1．流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2．泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3．流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合問:色質(zhì)聯(lián)用中毛細(xì)柱的選擇應(yīng)注意什么問題？答:1．柱效要高2．熱穩(wěn)定性好3．化學(xué)惰性強(qiáng)具體選擇應(yīng)注意1．柱極性。根據(jù)分析樣品選擇不同極性的柱子進(jìn)行分析2．柱子內(nèi)徑。內(nèi)徑大小決定柱容量3．液膜厚度。分析樣品溫度不一樣，對膜厚有不同要求，溫度高液膜要厚，溫度低液膜要薄4．柱長度。柱越長，柱效越高，分離效果越好，但也存在吸附問題，柱子過長，分析時(shí)間長，因此要根據(jù)樣品考慮柱子長度5．外涂層（柱體）的選擇。6．另外還有儀器型號(hào)、分析對象等因素問:液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？答:1．篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2．存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子問：從那些方面可以簡單判別毛細(xì)管柱子的熱穩(wěn)定性好壞？答：1.分配容量（或容量因子）K,好的柱子在高溫運(yùn)行后，分配容量K不應(yīng)有明顯的下降，否則，說明柱子的熱穩(wěn)定性不好理論塔板數(shù)n熱穩(wěn)定性好的柱子經(jīng)受高溫后，理論塔板數(shù)應(yīng)基本保持恒定柱子的極性。熱穩(wěn)定性好的柱子，高溫前后極性變化不大，具體表現(xiàn)為保留指數(shù)I值沒有大的變化。噪聲。熱穩(wěn)定性好的柱子在高溫下使用后，噪聲不能增加。柱子的去活層，毛細(xì)管柱子涂固定液前內(nèi)部一般要用去活性試劑去活以增加惰性。質(zhì)量好的毛細(xì)管柱子高溫后，去活層不應(yīng)該變化，表現(xiàn)在對強(qiáng)極性樣品或酸堿性樣品的吸附性不能增加。問：為什么進(jìn)樣器內(nèi)的玻璃襯套會(huì)對色譜行為造成影響？答：進(jìn)樣器內(nèi)的玻璃襯套主要有下列作用：提供一個(gè)溫度均勻的汽化室，防止局部過熱。玻璃的惰性不不銹鋼好，減少了在汽化期間樣品分解的可能性。易于拆換清洗，以保持清潔的汽化室表面，一些痕量非揮發(fā)性組分會(huì)逐漸積累殘存于汽化室，高溫下會(huì)慢慢分解，使基流增加，噪聲增大，通過清洗玻璃襯套可以消除這種影響?？筛鶕?jù)需要選擇管壁厚度及內(nèi)徑適宜的玻璃襯套，以改變汽化室的體積，而不用更換整個(gè)進(jìn)樣加熱塊。從以上幾個(gè)方面可以知道玻璃襯套對色譜行為造成影響的原因。問：毛細(xì)管色譜分流進(jìn)樣時(shí)，非線性分流的主要原因是什么？VAname="6">答:1.進(jìn)樣器溫度太低，樣品汽化不完全，發(fā)生分級(jí)分流。進(jìn)樣器溫度太高，某些組分可能發(fā)生熱分解，也有的樣品可能發(fā)生催化分解，或樣品部分地被吸附在進(jìn)樣器內(nèi)表面上。在分流點(diǎn)以前樣品沒有混合均勻或混合不充分。4．系統(tǒng)的進(jìn)樣墊、柱接頭等地方漏氣。問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法答:1．樣品量不足，解決辦法為增加樣品量2．樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子3．樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器4．檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。5．檢測器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)6．檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。7．檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。8．記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9．流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。10．檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線問：做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？答：原因可能有：1．泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理2．比例閥失效，更換比例閥即可；3．泵密封墊損壞，更換密封墊即可；4．溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法5．系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；6．梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。問：做PGS/MS分析時(shí)，如何防止焦油狀污染物進(jìn)入毛細(xì)柱？答：聚合物，尤其是一些含氮，硫及鹵素的高分子裂解時(shí)，常有焦油狀物質(zhì)產(chǎn)生。為防止這種焦油狀物質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)柱造成污染而使柱性能下降，可采用保護(hù)預(yù)柱，即在裂解器與毛細(xì)柱之間接一填充預(yù)柱，通過控制預(yù)柱溫度而使焦油狀物質(zhì)滯留在預(yù)柱內(nèi)，預(yù)柱可置于GC氣化室內(nèi)，這樣既容易控制溫度，又減少系統(tǒng)的死體積，當(dāng)然，預(yù)柱填料需經(jīng)常更換。問：我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？答：這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競爭物，如三乙基胺（TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。問：我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時(shí)柱壓過高，請問為什么？答：柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1．拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2．把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；3．將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；4．更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。問：高溫毛細(xì)柱的使用壽命一般為多長？答：毛細(xì)柱壽命鋤決定于柱子本身的性能外，在很大程度上取決于使用情況，如使用溫度、樣品狀態(tài)，進(jìn)樣量等，如果在其使用溫度范圍內(nèi)，樣品干凈，色譜柱不被污染的情況下，柱子壽命一般在2-3年之間。問：如毛細(xì)管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢復(fù)？是否可通過老化來解決？答：根據(jù)柱污染程度可采取不同的方法來解決，如果污染不嚴(yán)重，污染物沸點(diǎn)不是太高，可通過老化來解決，但老化溫度不可超過柱子的最高使用溫度，且一般要較長時(shí)間（8-30）小時(shí)，如果污染較嚴(yán)重，或通過老化仍不能使柱性能恢復(fù)，那就必須采用溶劑清洗，通常是用5倍柱容積的溶劑（如正戊烷，二氯甲烷等）通過色譜柱。當(dāng)然，清洗熔劑用的越多，對柱性能的損壞越大，清洗完后，在通載氣老化一定時(shí)間，如果柱性能恢復(fù)，便可繼續(xù)使用。必須指出：只有交聯(lián)柱才能清洗，對于非交聯(lián)柱，清洗柱子會(huì)徹底失效，因?yàn)楣潭ㄒ罕幌吹袅耍劣谇逑从萌蹌┑倪x擇，可參考說明書。問：BPX70毛細(xì)柱是否可用于GC/MS分析？答：完全可以。BPX70為極性柱，使用溫度范圍寬（25-260C）,程序升溫可達(dá)290C，流失低，適合于分析脂肪酸甲酯的的各種位置和幾何異構(gòu)體，藥物異構(gòu)體，碳水化合物等。因BPX70為交聯(lián)柱，故用于GC/MS很穩(wěn)定，污染后可清洗再生。用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？色質(zhì)聯(lián)用中毛細(xì)柱的選擇應(yīng)注意什么問題？液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？從那些方面可以簡單判別毛細(xì)管柱子的熱穩(wěn)定性好壞？為什么進(jìn)樣器內(nèi)的玻璃襯套會(huì)對色譜行為造成影響？毛細(xì)管色譜分流進(jìn)樣時(shí)，非線性分流的主要原因是什么？HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？做PGS/MS分析時(shí)，如何防止焦油狀污染物進(jìn)入毛細(xì)柱？我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時(shí)柱壓過高，請問為什么？高溫毛細(xì)柱的使用壽命一般為多長？如毛細(xì)管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢復(fù)？是否可通過老化來解決？BPX70毛細(xì)柱是否可用于GC/MS分析？問:用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？<Aname="1">答:關(guān)于漂移問題：1．溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2．流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3．柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡關(guān)于快速變化問題1．流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2．泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3．流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合問:色質(zhì)聯(lián)用中毛細(xì)柱的選擇應(yīng)注意什么問題？答:1．柱效要高2．熱穩(wěn)定性好3．化學(xué)惰性強(qiáng)具體選擇應(yīng)注意1．柱極性。根據(jù)分析樣品選擇不同極性的柱子進(jìn)行分析2．柱子內(nèi)徑。內(nèi)徑大小決定柱容量3．液膜厚度。分析樣品溫度不一樣，對膜厚有不同要求，溫度高液膜要厚，溫度低液膜要薄4．柱長度。柱越長，柱效越高，分離效果越好，但也存在吸附問題，柱子過長，分析時(shí)間長，因此要根據(jù)樣品考慮柱子長度5．外涂層（柱體）的選擇。6．另外還有儀器型號(hào)、分析對象等因素問:液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？答:1．篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2．存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子問：從那些方面可以簡單判別毛細(xì)管柱子的熱穩(wěn)定性好壞？答：1.分配容量（或容量因子）K,好的柱子在高溫運(yùn)行后，分配容量K不應(yīng)有明顯的下降，否則，說明柱子的熱穩(wěn)定性不好理論塔板數(shù)n熱穩(wěn)定性好的柱子經(jīng)受高溫后，理論塔板數(shù)應(yīng)基本保持恒定柱子的極性。熱穩(wěn)定性好的柱子，高溫前后極性變化不大，具體表現(xiàn)為保留指數(shù)I值沒有大的變化。噪聲。熱穩(wěn)定性好的柱子在高溫下使用后，噪聲不能增加。柱子的去活層，毛細(xì)管柱子涂固定液前內(nèi)部一般要用去活性試劑去活以增加惰性。質(zhì)量好的毛細(xì)管柱子高溫后，去活層不應(yīng)該變化，表現(xiàn)在對強(qiáng)極性樣品或酸堿性樣品的吸附性不能增加。問：為什么進(jìn)樣器內(nèi)的玻璃襯套會(huì)對色譜行為造成影響？答：進(jìn)樣器內(nèi)的玻璃襯套主要有下列作用：提供一個(gè)溫度均勻的汽化室，防止局部過熱。玻璃的惰性不不銹鋼好，減少了在汽化期間樣品分解的可能性。易于拆換清洗，以保持清潔的汽化室表面，一些痕量非揮發(fā)性組分會(huì)逐漸積累殘存于汽化室，高溫下會(huì)慢慢分解，使基流增加，噪聲增大，通過清洗玻璃襯套可以消除這種影響。可根據(jù)需要選擇管壁厚度及內(nèi)徑適宜的玻璃襯套，以改變汽化室的體積，而不用更換整個(gè)進(jìn)樣加熱塊。從以上幾個(gè)方面可以知道玻璃襯套對色譜行為造成影響的原因。問：毛細(xì)管色譜分流進(jìn)樣時(shí)，非線性分流的主要原因是什么？VAname="6">答:1.進(jìn)樣器溫度太低，樣品汽化不完全，發(fā)生分級(jí)分流。進(jìn)樣器溫度太高，某些組分可能發(fā)生熱分解，也有的樣品可能發(fā)生催化分解，或樣品部分地被吸附在進(jìn)樣器內(nèi)表面上。在分流點(diǎn)以前樣品沒有混合均勻或混合不充分。系統(tǒng)的進(jìn)樣墊、柱接頭等地方漏氣。問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法答:1.樣品量不足，解決辦法為增加樣品量樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器4．檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。5．檢測器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)6．檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。7．檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。8．記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9．流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。10．檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線問：做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？答：原因可能有：1．泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理2．比例閥失效，更換比例閥即可；3．泵密封墊損壞，更換密封墊即可；4．溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法5．系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；6．梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。問：做PGS/MS分析時(shí)，如何防止焦油狀污染物進(jìn)入毛細(xì)柱？答：聚合物，尤其是一些含氮，硫及鹵素的高分子裂解時(shí)，常有焦油狀物質(zhì)產(chǎn)生。為防止這種焦油狀物質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)柱造成污染而使柱性能下降，可采用保護(hù)預(yù)柱，即在裂解器與毛細(xì)柱之間接一填充預(yù)柱，通過控制預(yù)柱溫度而使焦油狀物質(zhì)滯留在預(yù)柱內(nèi)，預(yù)柱可置于GC氣化室內(nèi)，這樣既容易控制溫度，又減少系統(tǒng)的死體積，當(dāng)然，預(yù)柱填料需經(jīng)常更換。問：我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？答：這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競爭物，如三乙基胺（TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。問：我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時(shí)柱壓過高，請問為什么？答：柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1．拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2．把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；3．將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；4．更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。問：高溫毛細(xì)柱的使用壽命一般為多長？答：毛細(xì)柱壽命鋤決定于柱子本身的性能外，在很大程度上取決于使用情況，如使用溫度、樣品狀態(tài)，進(jìn)樣量等，如果在其使用溫度范圍內(nèi)，樣品干凈，色譜柱不被污染的情況下，柱子壽命一般在2-3年之間。問：如毛細(xì)管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢復(fù)？是否可通過老化來解決？答：根據(jù)柱污染程度可采取不同的方法來解決，如果污染不嚴(yán)重，污染物沸點(diǎn)不是太高，可通過老化來解決，但老化溫度不可超過柱子的最高使用溫度，且一般要較長時(shí)間(8-30)小時(shí)，如果污染較嚴(yán)重，或通過老化仍不能使柱性能恢復(fù)，那就必須采用溶劑清洗，通常是用5倍柱容積的溶劑(如正戊烷，二氯甲烷等)通過色譜柱。當(dāng)然，清洗熔劑用的越多，對柱性能的損壞越大，清洗完后，在通載氣老化一定時(shí)間，如果柱性能恢復(fù)，便可繼續(xù)使用。必須指出：只有交聯(lián)柱才能清洗，對于非交聯(lián)柱，清洗柱子會(huì)徹底失效，因?yàn)楣潭ㄒ罕幌吹袅耍劣谇逑从萌蹌┑倪x擇，可參考說明書。問：BPX70毛細(xì)柱是否可用于GC/MS分析？答：完全可以。BPX70為極性柱，使用溫度范圍寬(25-260C),程序升溫可達(dá)290C，流失低，適合于分析脂肪酸甲酯的的各種位置和幾何異構(gòu)體，藥物異構(gòu)體，碳水化合物等。因BPX70為交聯(lián)柱，故用于GC/MS很穩(wěn)定，污染后可清洗再生。色譜分析法概述(色譜講座,色譜基本理論)在一般情況下,不同物質(zhì)在不同的兩相,即固定相和流動(dòng)相中具有不同的分配系數(shù),當(dāng)這些物質(zhì)隨著流動(dòng)相移動(dòng)時(shí),它們在兩相中反復(fù)多次分配從而使各物質(zhì)得到完全的分離,這種分離技術(shù)稱為色譜法,亦稱作色層法或?qū)游龇?。這種分離技術(shù)用于分析測定,就是色譜分析。色譜法是俄國植物學(xué)家茨維特于1906年首先系統(tǒng)地提出來的。他在研究植物葉色素成分時(shí),使用了一根豎直的玻璃管,管內(nèi)充填碳酸鈣,然后將植物葉的石油醚浸取液由柱頂端加入,并繼續(xù)用純石油醚淋洗。因植物葉不同色素在柱內(nèi)得到分離而形成不同顏色的譜帶,茨維特稱這種分離方法為“色譜法”。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，色譜對象已不再限于有色物質(zhì)，但色譜這一名詞卻沿用下來。色譜法應(yīng)用于分析化學(xué)，并與適當(dāng)?shù)臋z測手段相結(jié)合時(shí)，就構(gòu)成了色譜分析法。通常所說的色譜法即色譜分析法。色譜法中，將上述起分離作用的柱稱為色譜柱，固定在柱內(nèi)的填充物(如碳酸鈣)稱為固定相，沿固定相流動(dòng)的流體(如石油醚)稱為流動(dòng)相。用液體作為流動(dòng)相的色譜法稱為液相色譜法,用氣體作為流動(dòng)相的稱為氣相色譜。固定相可以是固體或載附在惰性固體物質(zhì)(擔(dān)體)上的液體(固定液)。色譜法可以有不同的分類.例如: 氣相色譜(GC)用于沸點(diǎn)較低(v400°C)、具有較高熱穩(wěn)定性、分子量較小(<400)的有機(jī)物的分離。流動(dòng)相是氣體,而固定相通常是附著于擔(dān)體上的固定液或固體吸附劑。高效液相色譜(HPLC)一種利用高壓泵以增加分離效率的液相色譜.液相色譜(LC)用于在溶液里分離包括金屬離子和有機(jī)化合物的分析物.其流動(dòng)相為溶劑,固定相為吸附于擔(dān)體表面的流體、固體或離子交換樹脂.體積排阻色譜(SEC)也稱作凝膠滲透色譜(GPC),流動(dòng)相是溶劑，而固定相是一些多孔性物質(zhì)。薄層色譜(TLC)將吸附劑研成粉末,再壓成或涂成薄層,然后與紙色譜類似的方法分離樣品,是一種簡單快速的監(jiān)測化學(xué)反應(yīng)或有機(jī)化合物純度的方法。色譜柱使用及維護(hù)每天用足夠的時(shí)間來平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長！ 一定得做！新的色譜柱在使用之前應(yīng)該在您自己的液相色譜儀上進(jìn)行性能測試，即使用色譜柱附帶的檢驗(yàn)報(bào)告上測試條件和樣品來測定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時(shí)常對色譜柱進(jìn)行測試?？ㄌ字陌惭b（不加預(yù)柱）1．將卡套架套入柱芯2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夾套（見左圖）3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片4．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊5．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端6?連接到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用專用扳手注意：使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來，否則會(huì)造成填料的流失?？ㄌ字陌惭b（加預(yù)柱）1．將卡套架套入柱芯2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯（見左圖）3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片4．將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)5．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊6．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端7?連接到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用專用扳手更換色譜柱濾網(wǎng)和玻璃棉過濾片（同時(shí)可以修補(bǔ)色譜柱）注意：在取出反相柱芯的濾網(wǎng)和玻璃片之前，應(yīng)該將色譜柱充分用水和甲醇/乙腈沖洗，而且修補(bǔ)工具的頭部也應(yīng)該蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出濾網(wǎng)和玻璃棉濾片時(shí)帶出柱子內(nèi)的填料。1．將修補(bǔ)工具中的2套入柱芯的頂端2．將修補(bǔ)工具中的3輕輕地旋入已套著2的柱芯中，并順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)到旋緊3．一手握柱芯，另一只手輕輕地向外拉3，取出柱芯頂端的濾網(wǎng)4．用一個(gè)小鏟子輕輕地取出濾網(wǎng)下面的玻璃棉以及被污染的填料5．將新的填料用甲醇潤濕，然后填入挖去的部位，壓平6．照（左圖）裝上新的玻璃棉濾網(wǎng)，并用修補(bǔ)工具中的4將玻璃棉壓入柱芯頂端7．柱芯頂端套上2，然后參照（左圖）將濾網(wǎng)放入8．壓緊，然后取下2，再用4將濾網(wǎng)的邊緣壓平平衡色譜柱反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前應(yīng)使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡如何平衡色譜柱？平衡過程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）色譜柱的再生進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)謙價(jià)的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。表1建議用來沖洗的溶劑體積色譜柱尺寸柱體積所用溶劑