抗纖益心方抗擴(kuò)張型心肌病的藥效評(píng)價(jià)

抗纖益心方抗擴(kuò)張型心肌病的藥效評(píng)價(jià)

擴(kuò)張性心肌?。╟dm）是致充血性心力衰竭的主要原因，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前沒有具體的治療方法。11.1中藥免充配方顆粒見圖1抗纖益心方組成：紅參12g、黃芪30g、丹參15g、白術(shù)15g、茯苓12g、澤蘭15g、益母草15g、升麻9g、麥冬6g。由四川新綠藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供中藥免煎配方顆粒，批號(hào)：0074744155,每1.0g顆粒相當(dāng)于生藥8.0g,用生理鹽水溶解。輔酶Q10(10mg/片，衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，批號(hào)：187280)。呋喃唑酮片(0.1g/片，山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：138272)。1.2飼養(yǎng)環(huán)境概況80只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重(50±5)g,3w齡大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境恒溫、恒濕，溫度18℃～24℃,濕度50%～70%,12h交替照明。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)號(hào)：20180315WZ。1.3蛋白定量試劑盒蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1120-3);MDA、SOD和ATPase檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：mL077384、mL059387、mL038281);BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：IPVH0010);SDS凝膠試劑盒(西安晶彩生物公司，批號(hào)：JCPE022);抗UCP2抗體(批號(hào)：11081-1-AP)、抗β-actin抗體(批號(hào)：66009-1-lg),武漢三鷹生物公司。1.4主要成像設(shè)備SDS凝膠電泳系統(tǒng)(型號(hào)：Mini-PROTEAN)、蛋白濕轉(zhuǎn)儀(型號(hào)：MiniTrans-Blot)、WB成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiDocXRS+),美國(guó)伯樂公司。1.51.5.1模型準(zhǔn)備SD大鼠80只按9∶1分為造模組和正常對(duì)照組，造模組每日給予飲用70%呋喃唑酮水溶液誘導(dǎo)DCM1.5.2灌胃鹽水的制備將造模成功的40只大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型對(duì)照組、抗纖益心方高、低劑量組和輔酶Q10組，每組8只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每日灌胃生理鹽水。給予抗纖益心方3.6g/kg、1.8g/kg、輔酶Q1020.0mg/kg,連續(xù)給藥8w。治療期間模型對(duì)照組與藥物治療組繼續(xù)給予呋喃唑酮水溶液以保證致病因素的持續(xù)存在。1.5.3．定向m型示蹤用小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖在大鼠乳頭肌水平進(jìn)行二維定向M型示蹤，測(cè)量和計(jì)算LVESD、LVEDD、FS、LVEF。所有大鼠由一位專業(yè)超聲人員進(jìn)行檢測(cè)，每項(xiàng)測(cè)量連續(xù)三次心動(dòng)周期。1.5.4織物積分評(píng)價(jià)取4%多聚甲醛固定的心肌組織24h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，脫洗，HE染色，觀察病理學(xué)改變，并對(duì)心肌組織進(jìn)行積分評(píng)價(jià)，具體評(píng)價(jià)體系如下：0分，心肌組織無(wú)受損，細(xì)胞核排列較規(guī)則，肌纖維走行較整齊，心肌膠原沉積<5%;1分，輕度心肌受損，局部心肌纖維排列紊亂，心肌膠原沉積<5%～36%;2分，中度心肌受損，心肌纖維排列較紊亂，心肌膠原沉積<36%～60%;3分，重度心肌受損，心肌纖維排列紊亂，局部間質(zhì)水腫，心肌膠原沉積>60%。1.5.5通過透射電子顯微鏡和微微鏡對(duì)心肌細(xì)胞的骨骼進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)和自我分解剪取左心室心尖部位心肌組織，切成3個(gè)約1mm1.5.6生物素化抗體按照試劑盒嚴(yán)格要求進(jìn)行操作，各樣本檢測(cè)之前對(duì)其進(jìn)行勻漿、離心，取上清液，在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品100μL,37℃孵育90min,倒去孔內(nèi)的液體，加入100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60min,洗滌3次。加入100μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min,洗滌5次，加入90μL底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μL的終止液，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。1.5.7tbt的制備稱取大鼠心肌組織100mg,加入RIPA裂解液，在冰上研磨離心，BCA法測(cè)定蛋白的濃度后，以4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，100℃,5min,進(jìn)行凝膠電泳，4℃條件下加入一抗孵育過夜，37℃,1h,TBST清洗后，37℃二抗孵育1.5h,TBST洗膜后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影、拍照。以β-actin灰度值為內(nèi)參，用ImageJ軟件定量分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。1.5.8統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差22.1改變lvesd、lvedd和心臟指數(shù)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠LVESD、LVEDD和心臟指數(shù)明顯增加，F(xiàn)S和LVEF明顯降低(2.2部位組織病理學(xué)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組心肌組織明顯受損，細(xì)胞核排列不規(guī)則，部分細(xì)胞核固縮、碎裂，肌纖維排列、走形紊亂，膠原沉積，并出現(xiàn)間質(zhì)水腫，局部心肌纖維化嚴(yán)重。與模型對(duì)照組比較，抗纖益心方1.8、3.6g/kg組和輔酶Q1020.0mg/kg組心肌細(xì)胞形態(tài)與纖維排列順序明顯改善，表明抗纖益心方和輔酶Q10能夠減輕DCM大鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)異常改變，見圖1、表2。2.3小鼠小鼠小鼠小鼠肢體狀態(tài)正常對(duì)照組心肌細(xì)胞線粒體線狀排列呈橢圓形或圓形，線粒體嵴膜豐富完整、清晰，基質(zhì)清楚。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組線粒體排列紊亂，局部肌絲斷裂，線粒體腫脹伴空泡樣變化，邊界模糊不清。與模型對(duì)照組比較，抗纖益心方1.8g/kg、3.6g/kg組和輔酶Q1020.0mg/kg組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷明顯改善，促進(jìn)心肌能量代謝，見圖2。2.4型對(duì)照組mda、sod活力、atpase含量比較與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組MDA含量明顯增加，SOD活力、ATPase含量明顯降低(2.5ucp2蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照相比，模型對(duì)照組UCP2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(3臨床療效分析擴(kuò)張型心肌病在古典醫(yī)籍中無(wú)相關(guān)病名描述，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于“喘證”、“胸痹”、“心悸”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病發(fā)病多因先天稟賦不足、素體虛弱，或后天失養(yǎng)，或感受毒邪，內(nèi)舍于心，致心氣虧虛。王振濤教授臨床長(zhǎng)期從事治療DCM,根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為本病早期多以氣虛為本，瘀血、水濕為標(biāo)，疾病晚期可出現(xiàn)心腎陽(yáng)氣虛衰，導(dǎo)致諸臟腑功能失調(diào)。氣虛是本病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，存在于病變過程中的各個(gè)階段，因而提出益氣升陷活血法治療DCM,根據(jù)本法自擬抗纖益心方，在臨床上取得良好的效果。方中紅參大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)脾益肺，且能益血生津；黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，利水消腫，二者合用共為君藥。丹參既活血祛瘀，又能養(yǎng)血補(bǔ)心，麥冬味甘微寒，養(yǎng)陰潤(rùn)肺，清心除煩；且制約參芪術(shù)溫燥之性，為佐藥。益母草、澤蘭具有活血祛瘀，利水消腫作用；茯苓具有健脾滲濕，益心安神，白術(shù)有補(bǔ)氣健脾燥濕等功效。升麻入脾胃經(jīng)，善引脾胃清陽(yáng)之氣上升，與黃芪共用對(duì)氣虛下陷之癥其效顯著。故本方具有益氣升陷、活血利水功效。擴(kuò)張型心肌病主要以心腔擴(kuò)大，心肌收縮功能減退為特征，發(fā)病率和死亡率逐年升高能量代謝異常，氧化應(yīng)激發(fā)生在DCM發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。MDA是氧自由基引發(fā)脂類過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量高低反映氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度解偶聯(lián)蛋白-2(uncouplingprotein2,UCP2)作為線粒體內(nèi)膜的一類輕度解偶聯(lián)劑，是參與能量代謝的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的作用。能量的產(chǎn)生以及儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所是線粒體，在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和能量代謝等方面具有重要的作用。其通過質(zhì)子漏機(jī)制使線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過程脫偶聯(lián)，使能量以無(wú)效的熱能散失，ATP合成減少，UCP2過量表達(dá)導(dǎo)