激光掃描共聚焦顯微鏡-圖文講解

..激光掃描共聚焦顯微鏡吳旭2008.10.14高級顯微鏡原理正置、倒置顯微鏡細(xì)胞遺傳工作站活細(xì)胞工作站激光顯微別離系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡概述激光掃描共聚焦顯微鏡〔Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM〕生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要應(yīng)用通過一種或者多種熒光探針標(biāo)記后，可對固定的組織或活體樣本進(jìn)展亞細(xì)胞水平構(gòu)造功能研究高空間分辨率、非介入無損傷連續(xù)光學(xué)切片、三維圖像、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)等細(xì)胞構(gòu)造和功能的分析檢測……ConventionalfluorescencemicroscopeConfocalmicroscope歷史1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些根本原理，獲得了美國的專利。1967年，Egger和Petran成功地應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面。1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關(guān)系和激光掃描器的拉曼光譜學(xué)。1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺(tái)商品化的共聚焦顯微鏡，型號為SOM-100，掃描方式為臺(tái)階式掃描。1986年MRC-500型改良為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)。ConfocalmicroscopyesofageJGWhite&WBAmos.Nature328,183-184(09July1987Zeiss、Leica、Meridian、OlympusZeissLSM510激光掃描共聚焦顯微鏡ZeissLSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡ZeissLSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡NikonA1R激光掃描共聚焦顯微鏡PrairieUltimaIV活體雙光子顯微鏡國家光電實(shí)驗(yàn)室〔〕自制隨機(jī)定位雙光子顯微鏡LeicaTCSSP5激光共聚焦掃描顯微鏡根本原理相差、DIC常用熒光標(biāo)記共聚焦原理Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy.Thestainedportionsofthecellin(Areducetheamplitudeoflightwavesofparticularwavelengthspassingthroughthem.Acoloredimageofthecellistherebyobtainedthatisvisibleintheordinaryway.Lightpassingthroughtheunstained,livingcell(Bundergoesverylittlechangeinamplitude,andthestructuraldetailscannotbeseeneveniftheimageishighlymagnified.Thephaseofthelight,however,isalteredbyitspassagethroughthecell,andsmallphasedifferencescanbemadevisiblebyexploitinginterferenceeffectsusingaphase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscope.D.Phase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscopeFourtypesoflightmicroscopy.(ATheimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.Theotherimageswereobtainedbytechniquesdiscussedinthetext:(Bphase-contrastmicroscopy,(CNomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy,and(Ddark-fieldmicroscopy.常用熒光探針ProteinsNucleicAcidsDNAIonspHSensitiveIndicatorsOxidationStatesSpecificOrganelles熒光顯微鏡原理明場：透射熒光：落射落射的優(yōu)點(diǎn)：物鏡的聚光鏡作用使視場均勻，發(fā)射光強(qiáng)度高。激發(fā)光損失小，熒光效應(yīng)高。共聚焦原理由于pinhole的存在，使得局部雜散光〔虛線局部〕沒有被PMT探測器探測到，從而提高了成像效果。通過對樣品在x-y方向上的逐點(diǎn)掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)解焦平面在z方向的位置，連續(xù)掃描多個(gè)不同z位置的二維圖像，那么可以形成一個(gè)3D圖像，3D的重建需要軟件的支持。TheuniquescanningmoduleisthecoreoftheLSM510META.Itcontainsmotorizedcollimators,scanningmirrors,individuallyadjustableandpositionablepinholes,andhighlysensitivedetectorsincludingtheMETAdetector.Alltheseponentsarearrangedtoensureoptimumspecimenilluminationandefficientcollectionofreflectedoremittedlight.AhighlyefficientopticalgratingprovidesaninnovativewayofseparatingthefluorescenceemissionsintheMETAdetector.Thegratingprojectstheentirefluorescencespectrumontothe32channelsoftheMETAdetector.Thus,thespectralsignatureisacquiredforeachpixelofthescannedimageandsubsequentlycanbeusedforthedigitalseparationintoponentdyes.分光鏡組件構(gòu)造共聚焦構(gòu)成?光學(xué)顯微鏡?激光光源?掃描模塊〔包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡〕?光檢測器?計(jì)算機(jī)系統(tǒng)〔數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換應(yīng)用〕?圖形輸出設(shè)備LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管圖像相關(guān)概念RGB三基色圖像數(shù)據(jù)位亮度比照度飽和分辯率怎樣得到樣品圖像樣品的標(biāo)記物有適宜的激發(fā)波長和發(fā)射波長熒光下觀察選擇適宜的圖象設(shè)置激光掃描的通道參數(shù)設(shè)置圖象的屬性調(diào)節(jié)每一個(gè)通道的亮度、比照度、清晰度、背景亮度啟動(dòng)共聚焦和CCD照片的比擬更大的動(dòng)態(tài)圍高靈敏度圖像背景的消除靈活的拍照區(qū)域選擇ZOOM功能偽彩色環(huán)境要求高多通道圖象合成時(shí)間序列Ca離子成像FRAP：FluorescenceRedistributionAfterPhotobleachingFRAP是用來測定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，借助于高強(qiáng)度脈沖激光來照射細(xì)胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光粹滅，該區(qū)域周圍的非粹