呼吸道病毒多重核酸檢測試劑-醫(yī)療器械技術(shù)審評中心

#紋帶棒桿菌諾卡菌粘質(zhì)沙雷菌檸檬酸桿菌隱球菌煙曲霉黃曲霉肺抱子菌白念珠菌肺炎克雷伯菌根據(jù)《衛(wèi)計委下呼吸道感染細菌培養(yǎng)操作指南》，社區(qū)獲得性肺炎常見病原菌鸚鵡熱衣原體中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南Q熱立克次體文獻《兒童呼吸道病原體急性感染流行病學分析》注：*項為選擇性驗證7.精密度企業(yè)應(yīng)對精密度指標，如標準差或變異系數(shù)等的評價標準做出合理要求。模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應(yīng)同時包含若干臨床樣本，且精密度評價試驗應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素進行相關(guān)的驗證。（2）設(shè)定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。設(shè)定合理的精密度評價周期：包括3個以上地點，每個地點使用多名操作員；每天至少檢測2次、每次重復2次；檢測至少3－5個非連續(xù)日，以涵蓋待檢病毒日間變異，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。（3）用于精密度評價的人工模擬樣品和臨床樣本均應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當?shù)木芏纫螅R床樣本精密度評價中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為95%（n>20）臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n>20）中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CVS10%（n>20）（五）陽性判斷值確定資料陽性判斷值確定資料主要指對所有聲稱可檢出的病毒亞型核酸檢測的Ct值進行確認,建議申請人對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認。參考值范圍研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。（六）穩(wěn)定性研究資料穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料?？紤]到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。對于樣本提取后不能立即進行檢測的，應(yīng)明確核酸儲存條件、儲存時間等，同時應(yīng)提供相應(yīng)的核酸穩(wěn)定性研究資料。試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。（七）臨床試驗臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求。臨床試驗應(yīng)能檢出所有聲稱可檢出的呼吸道病毒及亞型，且每種病毒及常見亞型陽性樣本量應(yīng)具有統(tǒng)計學意義。病例選擇及樣本類型申請人應(yīng)選擇體征/癥狀符合呼吸道感染的目標人群，執(zhí)行前瞻性臨床試驗。申請人在建立病例納入標準時，應(yīng)考慮到各年齡段人群的差異，盡量覆蓋各個年齡段人群。在進行結(jié)果統(tǒng)計分析時，除總體病例數(shù)的要求外，建議對各年齡段人群分層進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（如<5、6－21、22－59和>60歲），總體病例數(shù)應(yīng)符合統(tǒng)計學要求。臨床試驗入組病例應(yīng)與產(chǎn)品預期用途中適用人群一致。臨床試驗應(yīng)首選新鮮樣本，且每種病毒亞型至少應(yīng)有前瞻性陽性樣本檢出。某些呼吸道病毒亞型在人群中具有低流行率，可用已知含特定病毒型或亞型的樣本（即留存樣本）和模擬樣本進行補充。如果選擇留存樣本，則應(yīng)證明凍存或其他保存方法的樣本穩(wěn)定性，且應(yīng)對樣本設(shè)盲，以免檢測偏差。模擬樣本應(yīng)明確病毒及亞型的鑒定方法、鑒定結(jié)果。參比方法申請人應(yīng)選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。如無已上市產(chǎn)品可選用病毒分離培養(yǎng)鑒定或測序方法進行比對，病毒培養(yǎng)應(yīng)選擇新鮮樣本。對于難以培養(yǎng)的呼吸道病毒（如人偏肺病毒）也可直接采用測序方法作為參比方法。測序試驗中的核酸擴增方法所測靶序列應(yīng)與申報產(chǎn)品所測測靶序列不同，且申請人應(yīng)對該靶序列/引物提供文獻或?qū)嶒炇覕?shù)據(jù)支持。申請人應(yīng)在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關(guān)于測序試驗的詳細信息及資料：（1）測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。（2）測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇、分子量、純度、功能性試驗等資料。（3）對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產(chǎn)品的相關(guān)性能進行適當比對分析。（4）測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。（5）提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。2.2病毒培養(yǎng)時，除細胞病變效應(yīng)（CPE）外，申請人還應(yīng)進行病毒鑒定如病毒特異性抗體染色或PCR擴增后測序。單純的CPE無法提供準確的病毒鑒別。申請人應(yīng)提供病毒分離培養(yǎng)的詳細實驗室流程，以及特定細胞系可作為分離某種病毒的文獻或數(shù)據(jù)支持。凍融樣本可能導致病毒喪失感染力，因此不推薦使用凍存樣本進行病毒培養(yǎng)。另外，申請人還應(yīng)根據(jù)病毒流行情況選擇每種病毒亞型核酸檢測陽性的新鮮采集樣本，使用考核試劑與呼吸道病毒感染檢測的“金標準”方法—病毒分離培養(yǎng)鑒定方法或其他證明呼吸道病毒感染的方法進行比較研究。如醫(yī)院無病毒培養(yǎng)條件，可由該醫(yī)院委托其他具有相應(yīng)條件的機構(gòu)進行。統(tǒng)計學分析對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。申請人應(yīng)分別統(tǒng)計各病毒及其亞型的靈敏度和特異性，同時應(yīng)分別統(tǒng)計混合感染樣本使用考核試劑和參比試劑的檢測結(jié)果。如考核試劑存在灰區(qū)，申請人還應(yīng)統(tǒng)計灰區(qū)樣本使用參比試劑的檢測結(jié)果。在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標準”方法或臨床上普遍認為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進行復核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。5.臨床試驗總結(jié)報告撰寫根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述。臨床試驗總體設(shè)計及方案描述臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數(shù)及標準、樣本編盲和揭盲的操作流程等。樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。具體的臨床試驗情況臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況、不同病毒及亞型分布情況進行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組和不同病毒及亞型的樣本例數(shù)。質(zhì)量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質(zhì)控品運行情況。具體試驗過程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測、結(jié)果處理、結(jié)果不一致樣本的確認等。5.3統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)預處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。5.3.2結(jié)果的一致性分析計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。5.4討論和結(jié)論對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。（八）產(chǎn)品技術(shù)要求申請人應(yīng)當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關(guān)文獻，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。呼吸道病毒核酸檢測試劑的產(chǎn)品性能指標應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒適用范圍內(nèi)不同病毒的檢測能力，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。如果申報試劑已有適用的國家標準品、參考品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。按照《辦法》的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑，申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。（九）產(chǎn)品注冊檢驗報告根據(jù)《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗。對于已經(jīng)有國家標準品、參考品的檢測項目，在注冊檢驗時應(yīng)采用相應(yīng)的國家標準品、參考品進行注冊檢驗，對于目前尚無國家標準品的、參考品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的企業(yè)參考品。（十）產(chǎn)品說明書說明書承載了產(chǎn)品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對呼吸道病毒核酸檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制?！绢A期用途】首段：試劑盒用于定性/定量檢測人鼻咽拭子、咽拭子或其他樣本的呼吸道病毒核酸，適用樣本類型應(yīng)結(jié)合實際的臨床研究完成情況進行確認。應(yīng)明確所有可檢測的病毒種類及亞型。簡單介紹待測目標的特征，如病毒種系淵源、生物學性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現(xiàn)、待測靶基因特征等。明確呼吸道病毒核酸試劑的臨床意義，通過對有呼吸道感染體征和癥狀的個體檢測和鑒別特異性病毒核酸，聯(lián)合其他臨床和實驗室結(jié)果以輔助診斷呼吸道病毒感染。陰性結(jié)果不能排除呼吸道病毒感染，不能用作診斷、治療或其他管理決策的唯一基礎(chǔ)。陽性結(jié)果不能排除細菌感染或其他病毒混合感染。待測人群特征介紹：具有呼吸道病毒感染癥狀的患者、相關(guān)的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等，待測人群應(yīng)與申報產(chǎn)品臨床試驗中入組人群一致。應(yīng)強調(diào)實驗操作人員應(yīng)接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業(yè)培訓，具備相關(guān)的實驗操作資格，實驗室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護程序。【檢驗原理】詳細說明試劑盒技術(shù)原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；介紹引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)體系（管）組合、對照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號標記等。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即udg/ung等），也應(yīng)對其作用機理作適當介紹。【主要組成成分】（1）說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有人源組分，應(yīng)提供其生物學來源、活性及其他特性；不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。（2）試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、貨號以及醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細信息。（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息?！緝Υ鏃l件及有效期】試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)與相應(yīng)的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致?！具m用儀器】所有適用的儀器型號，提供與儀器的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、型號以及醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細信息，以指導用戶操作?！緲颖疽蟆恐攸c明確以下內(nèi)容：（1）樣本采集時間點的選擇：是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。（2）對采樣拭子、容器及保存液的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求）、保存容器、轉(zhuǎn)運保存液的要求、轉(zhuǎn)運條件等。（3）樣本采集：具體采集部位及類型，詳述具體的操作方法或列出相關(guān)操作指南文件以指導使用者（最好能夠給出具體圖示），盡量減少由于樣本采集或處理不當對實驗造成的影響。樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。（4）樣本處理及保存：核酸提取前的預處理、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復室溫，凍融次數(shù)限制。有關(guān)描述均應(yīng)建立在相關(guān)性能評價及穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)上?！緳z驗方法】詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：試劑配制方法、注意事項。核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質(zhì)控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。擴增反應(yīng)前準備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項等。7.4逆轉(zhuǎn)錄過程的溫度和時間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項。儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標的熒光通道選擇等。質(zhì)量控制：說明對照品（質(zhì)控品）的檢測要求。質(zhì)控品如不與申報產(chǎn)品一同提供，應(yīng)說明質(zhì)控品規(guī)格，包括病毒水平、病毒來源、滅活方法和生物安全性測定方法?！娟栃耘袛嘀怠亢喴偨Y(jié)陽性判斷值研究方法及結(jié)論。【檢驗結(jié)果的解釋】結(jié)合對照品（質(zhì)控品）以及樣本管中靶基因和內(nèi)標的檢測結(jié)果，對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進行詳述。檢驗結(jié)果的解釋應(yīng)以陽性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應(yīng)在此項下引用，相應(yīng)檢驗結(jié)果的解釋應(yīng)符合相關(guān)指南的要求?！緳z驗方法的局限性】應(yīng)至少包括如下描述：本試劑檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學檢查結(jié)果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據(jù)。檢驗的病毒核酸出現(xiàn)序列變異時會存在假陽性風險。不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理以及不當?shù)膶嶒灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能導致假陰性或假陽性結(jié)果。應(yīng)明確申報產(chǎn)品所檢病毒亞型中經(jīng)過臨床驗證的型別，明確其余型別未經(jīng)臨床驗證。申報產(chǎn)品應(yīng)明確不同病程不同階段樣本的陽性率不一致。取標本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會導致檢測試劑檢測結(jié)果呈陽性。陽性和陰性預測值很大程度上取決于流行率。該檢驗性能是在［如2018/2019］流行季節(jié)期間確立。對某些病毒的檢驗性能可能隨檢測流行率和檢測人群變化。待檢核酸序列可