固相萃取-高效液相色譜法測定飼料中磺胺類藥物

固相萃取-高效液相色譜法測定飼料中磺胺類藥物

磺胺類藥物（sa）是指以對氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物，主要包括磺酰胺、磺間甲氧胺、磺酰胺、甲基丙烯酸酯、磺酰胺和甲基丙烯酸酯。廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。動(dòng)物組織、血液、蛋、奶、蜂蜜中磺胺類藥物的檢測方法已見諸報(bào)道,主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法或高效液相色譜柱前或柱后衍生熒光檢測法。而飼料中多種磺胺類藥物的檢測方法還未見報(bào)道,本文研究建立了SPE-HPLC-UV測定飼料中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉5種磺胺類藥物的方法,并將該方法用于不同飼料基質(zhì)中磺胺類藥物的測定,結(jié)果令人滿意。1材料和方法1.1水質(zhì)、速度和波長5μm,250mm×4.6mm)。選用乙腈和水作為流動(dòng)相,乙腈和水體積比例為25∶75,流動(dòng)相的流速為1.0mL/min;WATERS474二極管陣列檢測器,波長為270nm;WATERS717plus自動(dòng)進(jìn)樣器,進(jìn)樣量為20μL。1.2直接使用的藥物乙腈和甲醇為色譜純(Fisher公司);冰乙酸為優(yōu)級(jí)純(國產(chǎn));其他試劑為分析純,國產(chǎn),未進(jìn)一步處理直接使用?；前粪奏?、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司,純度>99%);堿性氧化鋁SPE小柱:SpeedSPECartridgesAluminaBasicALB(ABI公司),規(guī)格為1000mg/12mL。1.3乙腈溶液乙醇法分別配制5種磺胺的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,濃度為1mg/mL,乙腈溶解(磺胺喹惡啉用甲醇溶解)。-20℃冰箱保存1個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配,用流動(dòng)相定容。1.4樣品前處理1.4.1飼料中乙腈的提取稱取配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料樣品2g,置于具塞錐形瓶中,加入50mL的乙腈于振蕩器振蕩提取30min,過濾,濾液備用。1.4.2預(yù)混合飼料自然流速法準(zhǔn)確吸取試液(2.4.1):配合飼料10~20mL;濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料2mL,移入用10mL乙腈淋洗過的堿性氧化鋁小柱中,令其自然流速流出。待試液全部流出后吹干,用2次2mL流動(dòng)相洗脫,收集洗脫液,并過0.45μm的濾膜,濾液上機(jī)測定。2結(jié)果與討論2.1冰乙酸、乙腈、水和乙酸體積比對色譜圖的影響考察了乙腈+水+冰乙酸流動(dòng)相體系,結(jié)果如圖1所示。通過色譜圖可知,在乙腈、水和冰乙酸體積比為75∶25∶3時(shí)最為適宜。在此條件下,5種磺胺類藥物能夠達(dá)到基線分離。另外,金霉素、青霉素等藥物對其無干擾。2.2線性關(guān)系與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在優(yōu)化條件下,磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉等5種磺胺類藥物在0.2~200μg/mL濃度范圍內(nèi),濃度與響應(yīng)強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)高于0.999,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%。結(jié)果見表1。2.3樣品的預(yù)處理2.3.1樣品測定條件的確定飼料組成極為復(fù)雜,對磺胺類藥物的提取和測定干擾較大。在本研究中,考察了甲醇、70%酸性甲醇、乙腈和95%乙腈水4種提取劑的提取效果及對測定的影響。由圖2可知以甲醇和70%的酸性甲醇為提取劑時(shí),色譜圖基線不平,可能影響樣品的測定。而95%乙腈水對堿性氧化鋁小柱具有穿透作用,使得目標(biāo)分析物流失。因此,選擇乙腈作為提取劑。2.3.2配合飼料的制備考察了氧化鋁小柱的最大飽和容量,將標(biāo)準(zhǔn)溶液10μg/mL分別上柱2、5、10、20、30mL,結(jié)果如表2所示。由表中結(jié)果可知,堿性氧化鋁小柱對磺胺類藥物的承載量小于200μg。而磺胺類藥物在配合料中的添加量約為100~200mg/kg,在添加劑預(yù)混合飼料中大于1000mg/kg,在稱樣量為2g時(shí),配合飼料上樣量定為10mL;添加劑預(yù)混合飼料上樣量定為2mL。2.3.3洗脫溶劑及時(shí)間考察了75%乙腈水、25%乙腈水和純水3種洗脫液,每次用2mL洗脫液,洗脫3次,結(jié)果見表3。由表3可知,75%的乙腈水洗3次后仍有個(gè)別磺胺類藥物未被洗脫;而25%乙腈水、純水在3次洗脫后,洗脫液中已無任何磺胺類藥物。由于25%的乙腈水恰恰是流動(dòng)相的組成,因此確定用25%的乙腈水2mL洗脫2次。2.4不同濃度磺胺類藥物的加標(biāo)回收將該方法用于雞配合飼料和豬配合飼料中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉等5種磺胺類藥物的測定。考察了20、100、200mg/kg和400mg/kg濃度水平加標(biāo)回收,回收率結(jié)果(5次平均)見表4、5。在雞配合飼料中,4個(gè)濃度水平的磺胺類藥物的回收率高于77.7%,RSD≤8.0;在豬配合飼料中,4個(gè)濃度水平的磺胺類藥物的回收率高于80.2%,RSD≤8.7;由于在豬濃縮飼料中磺胺類藥物添加量較高,因此只考察了一個(gè)濃度水平的回收率,結(jié)果見表6。3