第5章蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程具備的知識(shí)基礎(chǔ)：分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)及化工、計(jì)算技術(shù)等蛋白質(zhì)工程課程的主要任務(wù)：1．掌握蛋白質(zhì)工程科學(xué)的基本原理、基礎(chǔ)知識(shí)2．熟悉蛋白質(zhì)科學(xué)與工程研究的主要方法和技術(shù)3．了解蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的研究方向與最新科技成果蛋白質(zhì)工程第一節(jié)緒論第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)第三節(jié)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)第四節(jié)蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)第五節(jié)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析和鑒定第六節(jié)蛋白質(zhì)工程的實(shí)際應(yīng)用蛋白質(zhì)工程第一節(jié)緒論內(nèi)容

（1）蛋白質(zhì)化學(xué)（2）蛋白質(zhì)工程2．基本要求

知道蛋白質(zhì)的概念，了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能；掌握蛋白質(zhì)工程的概念；蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系和區(qū)別緒論A蛋白質(zhì)化學(xué)B蛋白質(zhì)工程概念C蛋白質(zhì)工程操作流程D蛋白質(zhì)工程研究方向E蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫F蛋白質(zhì)工程研究成果及存在問題G基因工程概念H蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系與區(qū)別Protein:G.J.Mulder在1838年首次提出。蛋白質(zhì)是細(xì)胞原生質(zhì)的主要組成成分，其與核酸一起共同構(gòu)成了生命的物質(zhì)基礎(chǔ)概念：蛋白質(zhì)是由20種a-氨基酸組成的高分子有機(jī)物質(zhì),在體內(nèi)執(zhí)行多種生理功能蛋白質(zhì)化學(xué)一、蛋白質(zhì)的元素組成二、蛋白質(zhì)的分類三、蛋白質(zhì)的大小與分子量四、蛋白質(zhì)的功能五、蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)化學(xué)一、蛋白質(zhì)的元素組成

CHONS（50%）（7%）（23%）（16%）

（0～3%）Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I磷銅鐵鋅錳鈷硒碘

蛋白質(zhì)氮元素的含量都相當(dāng)接近，一般在15%—17％，平均為16％。這是凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的計(jì)算基礎(chǔ)

6.25

—16％的倒數(shù)，每測(cè)定１g氮相當(dāng)于6.25g的蛋白質(zhì)。也就是1g氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）蛋白質(zhì)含量＝蛋白氮×6.25一、蛋白質(zhì)的元素組成二、蛋白質(zhì)的分類三、蛋白質(zhì)的大小與分子量四、蛋白質(zhì)的功能五、蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)的分類

(Classificationofproteins)

(一).依分子形狀分類(Classifiedaccordingtoshape)球狀蛋白質(zhì)：血紅蛋白、血清球蛋白等纖維狀蛋白質(zhì)：膠蛋白、絲蛋白等(二).依蛋白質(zhì)組成（Classifiedaccordingtocomposition）簡單蛋白質(zhì)：水解為α-氨基酸結(jié)合蛋白質(zhì)：單純蛋白質(zhì)+輔基如色蛋白、糖蛋白、磷蛋白等(三).依蛋白質(zhì)溶解度（Classifiedaccordingtosolubility）清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、組蛋白、硬蛋白(四).依蛋白質(zhì)功能（Classifiedaccordingtofunction）活性蛋白質(zhì)非活性蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)的元素組成二、蛋白質(zhì)的分類三、蛋白質(zhì)的大小與分子量四、蛋白質(zhì)的功能五、蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)分子量的變化范圍很大，從大約6000—1000000道爾頓（Da）或更大某些蛋白質(zhì)是由兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)亞基(多肽鏈)通過非共價(jià)結(jié)合而成，稱寡聚蛋白質(zhì)。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達(dá)數(shù)百萬甚至數(shù)千萬道爾頓分子量>6000時(shí)，有完整的生物學(xué)功能分子量<6000時(shí)，不完全有生物學(xué)功能。一、蛋白質(zhì)的元素組成二、蛋白質(zhì)的分類三、蛋白質(zhì)的大小與分子量四、蛋白質(zhì)的功能五、蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)化學(xué)

蛋白質(zhì)的生物功能

Proteinshavemanydifferent

biologicalfunctions

1).酶的催化功能(Enzymaticcatalysis)Firefliesemitlightcatalyzedbyluciferase(熒光素酶)withATP2).運(yùn)輸和儲(chǔ)存功能TransportandstorageErythrocytes（紅細(xì)胞）

containalargeamountofhemoglobins（血紅蛋白）,theoxygen-transportingprotein.3).機(jī)械功能(Mechanicalfunctions)Theproteinkeratin（角蛋白）

isthechiefstructuralcomponentsofhair,scales,horn,wool,nailsandfeathers.4).運(yùn)動(dòng)功能(Movement)striatedskeletalmusclecell5).保護(hù)功能(Protection)6).信息傳遞功能

(Informationprocessing)SimpleAnatomyoftheRetina★蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義蛋白質(zhì)是一切生物細(xì)胞和組織的主要組成部分，是生命活動(dòng)所依據(jù)的物質(zhì)基礎(chǔ)2.生物的各種生物功能也都靠蛋白質(zhì)體現(xiàn)。如細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生物催化、物質(zhì)傳輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控以及記憶、識(shí)別等方面小結(jié)1）發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種不同功能和來源的蛋白質(zhì)2）其中有上千種蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序已被測(cè)定出來3）上百種已獲得高分辨的分子結(jié)構(gòu)解析圖這些成就,特別是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的特殊聯(lián)系方面的成就,為改造蛋白質(zhì)奠定了關(guān)鍵的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)化學(xué)的研究成果緒論A蛋白質(zhì)化學(xué)B蛋白質(zhì)工程概念C蛋白質(zhì)工程操作流程D蛋白質(zhì)工程研究方向E蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫F蛋白質(zhì)工程研究成果及存在問題G基因工程概念H蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系與區(qū)別蛋白質(zhì)工程誕生：1982年，Winter通過基因定位右邊得到了改性的酪氨酸t(yī)RNA合成酶1983年，Ulmer在“Science”上發(fā)表以“ProteinEngineering”(蛋白質(zhì)工程)為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標(biāo)志主要內(nèi)容：1）根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)2）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系

基本目的：1）實(shí)現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能2）設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)工程定義：

以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的修飾和合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計(jì)、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會(huì)需要的新型蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)工程緒論A蛋白質(zhì)化學(xué)B蛋白質(zhì)工程概念C蛋白質(zhì)工程操作流程D蛋白質(zhì)工程研究方向E蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫F蛋白質(zhì)工程研究成果及存在問題G基因工程概念H蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系與區(qū)別蛋白質(zhì)工程操作流程純化蛋白質(zhì)合成寡核苷酸晶體結(jié)構(gòu)模型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究基因文庫克隆化基因計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)M13克隆分子性質(zhì)及分子定向改造方案DNA序列分子測(cè)試性質(zhì)表達(dá)載體純化突變型蛋白質(zhì)突變體1、分離純化0.1-1.0mg純蛋白質(zhì)2、測(cè)定其部分肽段一段結(jié)構(gòu)，根據(jù)編碼原則合成相應(yīng)同位素標(biāo)記的寡苷酸探針3、以此從基因庫中分離編碼該蛋白質(zhì)的克隆化基因，轉(zhuǎn)入噬菌體M13系統(tǒng)，用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析4、通過表達(dá)載體獲得較大量(0.1-1.0克)該蛋白質(zhì)用于空間結(jié)構(gòu)測(cè)定及結(jié)構(gòu)與功能研究，借助計(jì)算機(jī)提出分子預(yù)測(cè)性質(zhì)及改造方案5、通過寡核苷酸M13系統(tǒng)定點(diǎn)誘變并分離其突變體，引入表達(dá)載體生產(chǎn)并純化突變性蛋白質(zhì)，分析其性質(zhì)指導(dǎo)進(jìn)一步分子設(shè)計(jì)，以最終獲得所預(yù)期性質(zhì)的分子

緒論A蛋白質(zhì)化學(xué)B蛋白質(zhì)工程概念C蛋白質(zhì)工程操作流程D蛋白質(zhì)工程研究方向E蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫F蛋白質(zhì)工程研究成果及存在問題G基因工程概念H蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系與區(qū)別1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3）改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)

主要研究方向1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（研究核心）

1）收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息2）建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究三維空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定是證明新結(jié)構(gòu)改變了原有生物功能的必需手段蛋白質(zhì)工程主要事件：1934年，胃蛋白酶的x射線衍射照片J.Bernal,D.Crowfoot1957年，肌紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)Kendrew1956年，維生素B12晶體結(jié)構(gòu)D.C.Hodhkin1959年，血紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)Perutz蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析主要技術(shù)：晶體學(xué)技術(shù)（x射線晶體結(jié)構(gòu)分析）：1.對(duì)原材料的要求：具有高度的均一性；影響因素有金屬離子、輔酶或一些成鍵的輔助集團(tuán)的變化或缺失；蛋白質(zhì)的酶解、氧化和還原；蛋白質(zhì)的聚合效應(yīng)等2.晶體生長的生化條件：pH值、離子強(qiáng)度、沉淀劑和添加劑的濃度等因素缺陷：需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克-幾十毫克），制備出單晶體，然后再進(jìn)行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計(jì)算和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析主要技術(shù)：多維核磁共振波譜技術(shù)：二維同核核磁共振方法：對(duì)氫原子核的二維核磁共振信號(hào)進(jìn)行分析，主要用于β類蛋白質(zhì)多維異核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白質(zhì)和α螺旋的多肽優(yōu)點(diǎn)：樣品要求低（蛋白質(zhì)可溶性、高穩(wěn)定性、高豐度）；分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)。已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計(jì)算機(jī)的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動(dòng)態(tài)機(jī)理?？梢愿行У胤治龅鞍踪|(zhì)的突變?nèi)秉c(diǎn)：僅限于分子量較小的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析研究現(xiàn)狀蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定已經(jīng)成為生命科學(xué)的“瓶頸”美國NIH投資1.25億美元，計(jì)劃測(cè)定1萬個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)；日本RIKEN將建16臺(tái)高分辨率核磁共振儀，用來測(cè)定小分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)技術(shù)上的障礙：在克隆、表達(dá)、純化和結(jié)晶過程中，大約20個(gè)蛋白質(zhì)中能得到1個(gè)可供結(jié)構(gòu)測(cè)定的晶體，并且一些蛋白質(zhì)（膜蛋白）根本不可能被結(jié)晶現(xiàn)階段主要研究手段根據(jù)氨基酸序列從理論上計(jì)算其相應(yīng)空間結(jié)構(gòu)成為蛋白質(zhì)領(lǐng)域內(nèi)科學(xué)家們的奮斗目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析主要研究方向：1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3）改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)工程2、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

1）對(duì)天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能2）根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程1、理論分析方法或從頭算方法(Abinitio)：該類方法假設(shè)折疊后的蛋白質(zhì)取能量最低的構(gòu)象2、統(tǒng)計(jì)方法：對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立序列到結(jié)構(gòu)的映射模型，進(jìn)而根據(jù)映射模型對(duì)未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)直接從氨基酸序列預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。這一類方法包括經(jīng)驗(yàn)性方法、結(jié)構(gòu)規(guī)律提取方法、同源模型化方法等

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)主要技術(shù)：分子動(dòng)力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時(shí)存在兩個(gè)原子等基本原則分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能研究現(xiàn)狀：尚在起步階段

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)主要研究方向：1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3）改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)工程創(chuàng)造和改造蛋白質(zhì)：1）物理、化學(xué)法：對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等2）生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等缺點(diǎn)：缺乏特異性，不能針對(duì)特定的部位起作用3）基因重組技術(shù)或人工合成DNA：可以改造蛋白質(zhì)而且可以實(shí)現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)工程修飾目標(biāo)明確在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質(zhì)功能之間關(guān)系之前，宜采用隨機(jī)誘變，造成堿基對(duì)的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標(biāo)限定在一定的區(qū)域內(nèi)，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標(biāo)DNA明確以后，就可以運(yùn)用定位突變等技術(shù)來進(jìn)行研究蛋白質(zhì)工程基因工程技術(shù)在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用定點(diǎn)突變：改變其中的一個(gè)或兩個(gè)三聯(lián)密碼就可以改變氨基酸盒式突變：1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)——盒式突變，一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對(duì)蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析PCR技術(shù)：直接、快速和高效

高突變率技術(shù)：①硫代負(fù)鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（α－（S）－dCTP）對(duì)某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成負(fù)鏈，然后用內(nèi)切酶處理，結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生“缺口”，用核苷酸外切酶III從3｀→5｀擴(kuò)大缺口并超過負(fù)鏈上錯(cuò)配的核苷酸，在聚合酶作用下修復(fù)正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因②UMP正鏈法：大腸桿菌突變株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產(chǎn)生的突變雙鏈轉(zhuǎn)化正常大腸桿菌，結(jié)果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負(fù)鏈保留并復(fù)制

蛋白質(zhì)融合：將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等

緒論A蛋白質(zhì)化學(xué)B蛋白質(zhì)工程概念C蛋白質(zhì)工程操作流程D蛋白質(zhì)工程研究方向E蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

F蛋白質(zhì)工程研究成果及存在問題G基因工程概念H蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系與區(qū)別蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫1、核酸序列數(shù)據(jù)庫EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory)http://www.ebi.ac.uk/embl/GenBank/GenBank2、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫由瑞士SwissInstituteofBioinformatics和

EuropeanBioinformaticsInstitute合建/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫3、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）由美國BrookhavenNationalLaboratory開發(fā)4、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（DSSP）WolfgangKabschandChirsSander設(shè)計(jì)http://www.sander.ebi.ac.uk/dsspftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dssp蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫緒論A蛋白質(zhì)化學(xué)B蛋白質(zhì)工程概念C蛋白質(zhì)工程操作流程D蛋白質(zhì)工程研究方向E蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫F蛋白質(zhì)工程研究成果及存在問題G基因工程概念H蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系與區(qū)別蛋白質(zhì)工程的成果1.基礎(chǔ)研究方面:

酪氨酰tRNA合成酶是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究得比較深入的酶之一。該酶在ATP存在的條件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸轉(zhuǎn)移到tRNA的3'