秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體加倍技術(shù)的研究進(jìn)展

秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體加倍技術(shù)的研究進(jìn)展

1979年，wenzil提出了“全面分解育種”方案，根據(jù)當(dāng)時(shí)的科技發(fā)展，采用了單倍體誘導(dǎo)技術(shù)、染色體再植技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)，其中倍性操作是該方案的重要組成部分。到目前為止秋水仙素是誘導(dǎo)植物體細(xì)胞染色體加倍的最有效的化學(xué)誘變劑,通過該法誘導(dǎo)培育出的良種已在生產(chǎn)中使用。本文就近年來在此領(lǐng)域中取得的成績做一概述。1生長點(diǎn)人工誘導(dǎo)加重秋水仙素是微管特異性藥物,由于適宜濃度的秋水仙素,能破壞紡錘絲的形成,因此可使分生細(xì)胞復(fù)制的染色體在細(xì)胞分裂時(shí)不能分向兩極,從而導(dǎo)致新生細(xì)胞的染色體加倍。1.1秋水仙素的處理方法1.1.1實(shí)體人工加倍處理法由于化學(xué)誘變的生理生化機(jī)理尚在爭(zhēng)論和進(jìn)一步研究中,導(dǎo)致化學(xué)誘變的方法和觀點(diǎn)不同。在實(shí)體人工加倍處理法中,普遍采用注射法、涂抹法、浸種法及包埋法,其中運(yùn)用秋水仙素水溶液直接浸泡種子的方法成功地在君子蘭、菊花腦、油菜等植物上誘導(dǎo)出了多倍體,但其有效誘導(dǎo)效率低,而且秋水仙素用量太大,毒害作用最為直接,同時(shí)也可以因缺氧而死亡。用注射器將秋水仙素注入生長點(diǎn)的方法在成齡桑上成功的誘導(dǎo)四倍體,但針頭易刺傷生長點(diǎn),而造成生長點(diǎn)霉?fàn)€死亡,誘導(dǎo)效率低。陳紹潘等用涂抹生長點(diǎn)方法處理甜菊實(shí)生苗時(shí),用8次點(diǎn)滴處理,誘變率可達(dá)31.25%,該法雖然可以避免對(duì)生長點(diǎn)的機(jī)械損傷,死亡相對(duì)少一些,但難使藥劑與生長點(diǎn)完全接融。而用脫脂棉包埋生長點(diǎn)或胚芽則較好的解決了上述問題,在生姜、成齡桑上均獲得了較好的效果。人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),在實(shí)體人工誘導(dǎo)加倍中,秋水仙素作用的主要對(duì)象是生長點(diǎn),只有生長點(diǎn)的細(xì)胞全部加倍,才能獲得加倍成功的植株,但這種幾率很小,由此獲得加倍材料多為嵌合體,往往不能穩(wěn)定遺傳,而且受環(huán)境干擾大,并且可能產(chǎn)生回復(fù)突變。而隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,使得秋水仙素可以在離體條件下誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞染色體加倍,獲得多倍體再生,克服常規(guī)人工加倍處理方法的缺陷。1.1.2離體培養(yǎng)加倍法從已有的報(bào)道來看,離體條件下染色體加倍的途徑有兩條,一是先用秋水仙素溶液處理培養(yǎng)材料,然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基;二是在含秋水仙素的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間,誘導(dǎo)加倍,再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。近年來研究發(fā)現(xiàn),離體培養(yǎng)條件下染色體加倍具有明顯的優(yōu)越性:試驗(yàn)條件容易控制,試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng),工作效率高,嵌合體發(fā)生率低。因此,用秋水仙素進(jìn)行離體組織的染色體加倍,尤其是第二條途徑日益受到重視。Novak早在1983年用3%秋水仙素+4%的DMSO采用上述兩種方法處理大蒜莖尖,兩種方法的誘導(dǎo)率分別為6.25%、24.32%。2影響染色體再植被頻率的因素2.1內(nèi)部控制2.1.1外植體的誘導(dǎo)誘導(dǎo)近年來隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展,一般認(rèn)為,植株上任一生物學(xué)部分作為外植體,只要秋水仙素濃度與處理時(shí)間適宜,結(jié)合相應(yīng)的培養(yǎng)基均可獲得變異的多倍體。到目前為止,在體細(xì)胞染色體加倍試驗(yàn)中,外植體一般為愈傷組織、種子、芽、胚狀體、莖尖分生組織及花柄、葉片、花莖組織培養(yǎng)所得的原球莖。此外,花粉亦有報(bào)道。但由于不同外植體的生理生化狀態(tài)不同,尤其是內(nèi)源激素有差異,必然影響不同外植體染色體的加倍頻率。周樸華等在對(duì)黃花菜染色體加倍研究中發(fā)現(xiàn),用黃花菜的花柄作為外植體培養(yǎng)出來的球狀體,經(jīng)秋水仙素水溶液處理后,所獲得的變異染色體數(shù)目多種多樣;而來自葉片、花莖的球狀體,繼代培養(yǎng)再生植株能力強(qiáng),再生植株形態(tài)及細(xì)胞染色體數(shù)目比較穩(wěn)定,是黃花菜組織培養(yǎng)和人工誘導(dǎo)加倍的適宜外植體。張素芝(2001)在大蒜多倍體誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn),利用氣生鱗莖和莖盤誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織,較適合于秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)誘導(dǎo)染色體加倍。由此可見,外植體的來源對(duì)誘導(dǎo)效果十分重要。另外,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)對(duì)供體外植體的處理時(shí)期,亦對(duì)誘導(dǎo)效果有影響,種子和芽可以在休眠狀態(tài)或代謝合成旺盛階段進(jìn)行處理,但生長點(diǎn)處理越早,獲得的多倍體數(shù)目愈多,處理時(shí)間愈晚,則大多數(shù)為嵌合體。2.1.2低倍體的材料比易染色體加重雷家軍等在草莓莖尖染色體加倍研究中發(fā)現(xiàn),不同的試材加倍成功率不同,五葉草莓(2x)較易培養(yǎng)成功,而中間雜種一號(hào)(5x)則較難獲得,在該試驗(yàn)中共得到2x加倍成4x株系19個(gè),5x加倍成10x株系5個(gè),8x加倍稱16x株系3個(gè)。由此可見,低倍體的材料較易染色體加倍,這可能是因?yàn)榈捅缎圆牧闲纬傻挠鷤M織,在秋水仙素處理時(shí)更易發(fā)生有絲分裂的反常,更易進(jìn)行染色體的核內(nèi)復(fù)制,從而引起染色體的加倍。Owen通過流式細(xì)胞儀對(duì)馬鈴薯單元單倍體(monohaploid)和多倍體DNA含量分析中指出,單元單倍體在進(jìn)行DNA復(fù)制期間,其多倍化細(xì)胞明顯高于雙單倍體(amphiploid)加倍細(xì)胞。2.2外部原因2.2.1對(duì)不同作物濃度的秋水仙素提取效果秋水仙素的濃度和處理時(shí)間是影響染色體加倍的最重要的外在條件。用秋水仙素水溶液處理外植體時(shí),關(guān)于濃度和處理時(shí)間的最適宜組合問題尚有不同看法。有些學(xué)者認(rèn)為低濃度、長時(shí)間的組合較好;但還有一些學(xué)者則傾向于高濃度、短時(shí)間的組合。不同的作物有其最適的組合,張建軍等在對(duì)蒔菜加倍時(shí),適宜的秋水仙素濃度為100mg/l,處理時(shí)間為10~14d;而在生姜體細(xì)胞染色體加倍時(shí),適宜濃度30mg/l、處理時(shí)間5d為最佳組合。這可能是由于不同來源的外植體對(duì)秋水仙素的反應(yīng)、耐受能力及敏感程度不同所致。2.2.2在乙醇介質(zhì)中的應(yīng)用處理溫度對(duì)藥劑的水解速度影響很大,由于在低溫下藥劑的水解速度緩慢,所以誘導(dǎo)劑能保持一定的穩(wěn)定性,但對(duì)細(xì)胞的有效作用卻減弱;相反,在高溫條件下雖然有效作用增強(qiáng),但是同時(shí)也加速了它在溶液中的變性過程?，F(xiàn)在普遍采用變溫處理解決這個(gè)問題。張素芝(2001)在對(duì)大蒜多倍體誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn),溫度對(duì)四倍體的誘導(dǎo)率影響很大,較高的溫度、短時(shí)間的處理效果較好;較低的溫度,時(shí)間則應(yīng)延長一些。2.2.3對(duì)秋水仙素的影響紀(jì)鳳高在誘導(dǎo)小麥多倍體植株時(shí),發(fā)現(xiàn)DMSO能促進(jìn)秋水仙素快速浸透到植物組織中,并顯著提高秋水仙素的加倍效果。Novak認(rèn)為DMSO能減輕秋水仙素的藥害作用,并降低嵌合體的發(fā)生率。這與佘建明的結(jié)果相一致。3早期鑒定方法經(jīng)過秋水仙素處理以后,有些材料的染色體加倍,有些未發(fā)生加倍,還有些為嵌合體。因而其加倍效果的鑒定,是倍性操作的重要一步。目前的鑒定方法主要有以下幾種:3.1形態(tài)鑒定法植物體細(xì)胞染色體加倍后,分化生成的多倍體植株,一般表現(xiàn)為巨大性。通常莖變粗短,葉片變厚、有時(shí)比較粗糙或生皺紋,多毛,花朵、果實(shí)和種子變大,生育期延長,整個(gè)植株變成巨型,這些特征都可作為判別多倍體的根據(jù)。這為早期辨認(rèn)出多倍體,便于對(duì)多倍體的生長狀況和經(jīng)濟(jì)性狀做比較觀察,提供了可能。3.2氣孔鑒定法目前,人們已經(jīng)可根據(jù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目、單位面積的氣孔數(shù)目、氣孔的長度和寬度,進(jìn)行多倍體的鑒定。鄭紅軍等在蘋果三倍體和二倍體氣孔性狀的研究中發(fā)現(xiàn),在二、三倍體品種間,有四個(gè)性狀都存在明顯的差異,以葉綠體數(shù)目和氣孔密度差異最大,其次為氣孔長度,差異最小的為氣孔寬度。在利用這些性狀進(jìn)行倍性鑒定時(shí),應(yīng)以葉綠體數(shù)目和氣孔密度為主,用氣孔大小作為參考。3.3花粉粒鑒定法李斌貝等在研究中發(fā)現(xiàn),蘋果花粉粒的大小及不同花粉數(shù)目,可鑒定倍性,而且測(cè)出了判定二倍體與三倍體不同形狀花粉粒數(shù)目比值的臨界值。一般四倍體的花粉比二倍體大一倍或百分之幾十。3.4染色體數(shù)目鑒定法盡管早期可以通過上述3種方法初步鑒別出多倍體,但要斷定為多倍體還要進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定,多采用植物組織培養(yǎng)物的染色體制片技術(shù)進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),該法是到目前為止最為直觀準(zhǔn)確的鑒定方法。如菊花腦二倍體染色體數(shù)為2n=18,經(jīng)秋水仙素處理后,通過對(duì)四株變異株根尖細(xì)胞染色體鏡檢證明有四倍體存在,染色體數(shù)為2n=36?，F(xiàn)在已有報(bào)道,通過掃描細(xì)胞光度儀來測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的DNA含量,然后根據(jù)DNA含量比較來推斷細(xì)胞的倍性水平。4對(duì)紡錘體染色體的缺陷的認(rèn)識(shí)盡管在細(xì)胞有絲分裂中,秋水仙素能夠阻止紡錘體的形成而使染色體加倍,但是隨著研究的深入,目前在實(shí)際應(yīng)用中已經(jīng)出現(xiàn)了不容回避的問題。4.1種子萌發(fā)和根生長秋水仙素有劇毒,對(duì)外植體有毒害作用,常常使材料在處理過程中死亡,而且抑制種子的萌發(fā)和根的生長。與組織培養(yǎng)結(jié)合時(shí),不但使離體組織受害,明顯抑制不定芽分化,再生植株生長緩慢,甚至可使外植體在繼代培養(yǎng)中褐化死亡。4.2加多倍體的限制嵌合體是指具有兩種或兩種以上基因的植株,到目前為止,至少描述過一種嵌合體現(xiàn)象的有100多個(gè)屬,可能是因?yàn)樵谔幚磉^程中,并不是全部分生細(xì)胞的染色體數(shù)都同樣的加倍,有可能是某些細(xì)胞加倍了或加倍再加倍,而有的細(xì)胞沒加倍。成功的處理使多數(shù)細(xì)胞都能加倍,盡可能的減少未加倍的細(xì)胞,這樣才能保證加倍的細(xì)胞繁殖;否則未加倍的細(xì)胞會(huì)因?yàn)榉至丫徛馓蕴?。但是到目前為?嵌合體現(xiàn)象還不能完全克服,真正的同一倍性的多倍體出現(xiàn)的頻率不高。Frandsen對(duì)馬鈴薯實(shí)生苗和實(shí)生種子進(jìn)行了秋水仙素處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%的實(shí)生苗產(chǎn)生了嵌和體現(xiàn)象,像這種嵌合體在生長過程中能否保持加倍特性,必然依賴于生長點(diǎn)是否受秋水仙素的影響,依賴2x與4x的生存競(jìng)爭(zhēng)。4.3秋水仙素的誘導(dǎo)技術(shù)研究因?yàn)槎啾扼w的產(chǎn)生,受外植體的生長狀態(tài)、倍性水平,以及秋水仙素的處理時(shí)間、濃度、溫度和滲透劑的影響,要使秋水仙素誘導(dǎo)多倍體成為一項(xiàng)成熟的技術(shù),還需要在更多的植物上開展廣泛的研究。尤其是外植體的生長狀態(tài),對(duì)加倍效果的影響機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究。5有利于促進(jìn)野生種優(yōu)良抗性及品質(zhì)基因向栽培品種的轉(zhuǎn)移近年來,隨著生物技術(shù)的發(fā)展,染色體加倍技術(shù)開始由秋水仙素加倍法、組織培養(yǎng)加倍法發(fā)