凝膠過濾層析課件

實驗十凝膠過濾層析純化細胞色素C

凝膠過濾層析一、目的要求1.學習和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。2.通過凝膠過濾柱層析對細胞色素C進行純化凝膠過濾層析二、原理凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進行分離。凝膠過濾層析Vt=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/Vi凝膠過濾層析Kd=0Kd=10<Kd<1Kd>1凝膠過濾層析優(yōu)點：a.條件溫和b.操作簡便c.損失少回收率高d.層析柱可反復使用凝膠的類型：Sephadex:交聯(lián)葡聚糖Sepharose：瓊脂糖凝膠Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范圍（肽與蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000凝膠過濾層析凝膠及柱的選擇凝膠過濾層析凝膠的處理及裝柱凝膠干粉的溶脹（熱溶脹）、浮選、抽氣、裝柱、藍色葡聚糖檢查、平衡裝柱時要注意操作壓。凝膠過濾層析裝柱的兩種方法：a.手工操作

1/3床體積水→加入少許凝膠積起1-2厘米凝膠床→打開出水口→連續(xù)緩慢加入凝膠b.電動攪拌下的裝柱法

（如圖4-9）凝膠過濾層析樣品上柱分析用量：柱床體積的1—2%制備用量：柱床體積的20—30%洗脫收集部分收集器、核酸蛋白檢測儀凝膠的保存方法0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰凝膠過濾層析應用a.分離蛋白質(zhì)b.脫鹽c.蛋白質(zhì)分子量的測定凝膠過濾層析三、儀器的使用－核酸蛋白檢測儀及部分收集器的操作方法

凝膠過濾層析凝膠過濾層析記錄儀凝膠過濾層析1、在儀器使用前，首先檢查檢測器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。

2、接通記錄儀電源開關(guān)，使電源開關(guān)拔到“通”指示燈亮。記錄儀有兩檔走紙速度，每小時3厘米和每小時12厘米，可根據(jù)記錄儀說明書調(diào)換不同的走紙速度。3、將波長旋鈕旋到所需波長刻度上，把量程旋鈕拔到100％T檔。4、按下ON電源箱面板上的電源開關(guān)，此時記錄儀指針從零點開始向右移動某一刻度，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置5mV左右數(shù)字顯示為50左右。儀器開機穩(wěn)定時間大約在1小時左右，待基線平直后，可加樣測試。凝膠過濾層析5、把檢測器進樣口塑料管接到部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過。透光率為"0"廠家巳調(diào)好，光密度A要調(diào)零，量程開關(guān)拔到100％T，調(diào)節(jié)光量旋鈕，使記錄儀指針在100mV數(shù)字顯示為100，即透光率為100%。把量程開關(guān)拔到“A"擋，緩慢調(diào)節(jié)A調(diào)零旋鈕，使記錄儀指示在"0"位，數(shù)字顯示為“0"。

6、上述5個步驟結(jié)束后，就可以在層析柱上加樣。當樣品經(jīng)層析柱分離，通過檢測后，就能通過記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。7、測試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。凝膠過濾層析注l:記錄儀光吸收A讀數(shù)當采用l0mV量程記錄儀時，記錄儀的滿量程讀數(shù)對應于A量程開關(guān)所對應的A讀數(shù)范圍。如A量程開關(guān)選定在0-0.5A時，則記錄儀滿量程光吸收A讀數(shù)為0.5，當記錄筆指示在記錄紙一半(50%刻度)位置時即為0.25A。注2:數(shù)字顯示光吸收A讀數(shù)(可變量程讀數(shù)模式)

當A量程開關(guān)選定在0-1.0A檔時，此時數(shù)顯板上顯示和讀數(shù)即為光吸收A的實際讀數(shù)，如顯示為080即表示為0.80A。當A量程開關(guān)切換在其它量程位置時，則數(shù)顯光吸收A讀數(shù)為:A量程選定在0-2.0檔時，數(shù)顯讀數(shù)×2=實際光吸收讀數(shù)AA量程選定在0-1.0檔肘，數(shù)顯讀數(shù)×1=實際光吸收讀數(shù)A凝膠過濾層析部分收集器的操作方法

1．將“手/自”框內(nèi)的鍵置于自動狀態(tài)，按“定”和“停”;使定時時間為零，放開“停”按“快”或“慢”(“定”仍按著)至所需的定時時間，放開"慢"和“定”，再按一下"停"設定定時時間工作就完畢。若要查看設置時間，則只需按一下“定”鍵，就能顯示上一次所設時間，若要以秒顯示走時時刻，則需按下“秒”鍵。

凝膠過濾層析2．定位，將“順/逆”鍵置于“順”或“逆”狀態(tài)，按“手動”鍵，使試管架轉(zhuǎn)至終點，這時報警器工作，報警指示燈亮，然后將“順/逆”鍵置于“逆”或“順"狀態(tài)，本儀器就會自動地對準第一個試管(在“順"狀態(tài)，第一臂試臂為最內(nèi)的那根。在"逆"狀態(tài)，第一臂試管為最外的那根)。如滴管口沒對準第一根試管只要松開換節(jié)臂調(diào)整螺釘，使滴臂口對準第一根試管即可。凝膠過濾層析四、操作方法（一）凝膠的選擇與處理1.凝膠及柱的選擇根據(jù)細胞色素C的分子量選擇SephadexG100。選用1.5cm×60cm的柱子。2.凝膠的處理凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消毒。凝膠過濾層析（二）裝柱

1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出。

2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。（三）凝膠柱的平衡通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保護凝膠上端有一段液體。

凝膠過濾層析（四）加樣1.準備好部分收集器、核酸蛋白檢測儀及記錄儀2.打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將細胞色素C樣品溶液5mL小心加到凝膠床面上，應避免將床面凝膠沖起，打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，當樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液沖洗管壁2次。最后加入3－4mL洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽，柱進水口連通恒壓瓶，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連（如圖）。（五）洗脫洗脫時，打開上、下進出口夾子，用0.025mol/LTris-HCl，以每管3mL/10min流速洗脫，用自動部分收集器收集流出液。凝膠過濾層析凝膠過濾層析(六）收集細胞色素C收集帶有紅色的洗脫液，即為經(jīng)凝膠過濾柱層析純化的細胞色素C。凝膠過濾層析五、注意事項1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)的排氣管應無液體，如隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓、正常。2）