生化反應工程-周華從

,制藥反應工程,第六章 生化反應工程基礎 趙瑞芬 周華從 2015年11月,生化反應工程基礎知識；生化反應工程特點；,酶催化反應及其動力學；微生物反應及其動力學；,6.1,概述,6.2,生化反應動力學基礎,固定化生物催化劑,生化反應器,酶和細胞的固定化；固定化生物催化劑的催化動力學；,生化反應器類型；生化反應器計算,6.3,6.4,生化反應工程基礎知識；生化反應工程特點；,酶催化反應及其動力學；微生物反應及其動力學；,6.1,概述,6.2,生化反應動力學基礎,6.1 概述,生化反應 工程,生物化學 工程,化學反應 工程,使用生物催化劑；生物技術實現(xiàn)產業(yè) 化的關鍵之一。,生化反應本質是化學反應；用化學反應工程的原理和方 法解決生化反應問題,生化反應工程將化學反應工程的原理和方法用于生化反應及生化反應器設計、分析及確定最優(yōu)操作條件的一門科學分支。,6.1.1 生化反應工程基礎知識,研究對象：生物催化劑與生化反應、生化反應器設計與分析,6.1 概述,反應工程研究內容,反應工程,反應動力學,反應器設計與分析,研究內容：,？,生化,生化,生化,6.1.1 生化反應工程基礎知識,游離酶或固定化酶、游離細胞或固定化細胞。,6.1 概述,原料預處理；生物催化劑制備及生化反應；產品分 離與純化。,應用生物學、化學和工程學的基本原理，利用生物體 （如微生物、動/植物細胞）或其組成部分（如酶或細 胞器)來生產有用物質，或為人類提供某種服務的技術。,生物催化劑：,生化反應：,生物技術：,由生物催化劑催化的反應。包括三個過程：,與化學反應過程相比較，生化反應過程具備以下特點：,6.1 概述,6.1.2 生化反應工程特點,生物催化劑除單酶體系外，多酶或微生物細胞催化體系復雜；通常為氣液固多相系統(tǒng)，反應物系復雜，；具有反應條件溫和、催化專一性強和反應選擇性高的優(yōu)點；生物催化劑對環(huán)境敏感，對反應器的構造和過程控制要求較高；反應速率通常受到反應物和產物濃度的限制，且所需反應器體積較大。,一、 酶的概述,1 酶的分類：,酶(Enzyme)是由活細胞產生的具有催化活性和高度 選擇性的特殊蛋白質。,組 成,單純蛋白質,酶蛋白分子與輔助因子組成全酶,酶的分類：按照酶催化反應類型，分為：,氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶和合成酶,參考：生物化學，王鏡巖 等，第三版，北京大學出版社,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,酶具有一般化學催化劑所具有的性質。,降低反應的活化能；不影響反應的平衡常數(shù)；加速反應的進行；酶本身不被消耗，且能恢復到原來的狀態(tài)。,酶同時具有蛋白質的性質。,需要適宜的反應溫度、pH、溶劑的介電常數(shù)、離子強度等，極易受到物理因素和化學因素的影響，容易失活甚至變性。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,2 酶的特性 ：,E (Enzyme), 酶；,S (Substrate), 底物；,以單底物S生成產物P的酶催化反應為例，其反應歷程為：,P (Product), 產物；,酶和底物非共價鍵結合，形成酶-底物中間絡合物ES；ES絡合物解離，生成產物P并釋放E, 開始下一個底物 的反應。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,3 酶催化反應歷程 ：,酶的活性：即酶催化反應速率，在規(guī)定條件下，每微摩爾酶每分鐘催化底物轉化的微摩爾數(shù)。,酶單位：在規(guī)定條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉化為產物所需的酶量，定義為一個酶單位（U, Unit）。,二者關系：若酶的活性為 a mol /(min mol ），則一個酶單位可表示為 1/a mol/(min mol ),6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,4 酶的活性定義：,酶催化與化學催化反應能量變化,與化學催化相比較，酶催化有如下特點：,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,5 酶催化特點：,酶的催化效率高：通常比非酶催化高107 1013倍。,？,酶催化降低了從底物到過渡態(tài)絡合物所需的活化能，且不改變反應中總能量的變化。,專一性,酶對底物的專一性,底物結構專一性,立體專一性,酶對基團的專一性, 酶催化反應具有高度的專一性：,酶對反應的專一性,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,5 酶催化特點：,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學, 反應條件溫和；, 選擇性高，副產物少，易于分離；,對環(huán)境因素敏感，具有適宜的反應溫度、pH、離子 強度等。,5 酶催化特點：,反應溫度：酶催化反應速率與溫度曲線呈鐘罩形。 反應pH：影響酶與底物結合和解離的速率；甚至影響 酶的空間結構,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,6 影響酶催化反應速率的因素：, 酶濃度、底物濃度、產物濃度、離子強度和抑制劑等。,對于典型的單底物酶催化反應：,反應機理可表示為：,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,二 單底物酶催化反應動力學米氏方程,一定條件下，反應速率 r與底物濃度S關系：,通過米氏方程(Michaelis-Menten Equation)定量描述反應速率與底物濃度的關系：,cS為底物S的濃度；rmax=k2cE0是最大反應速率(所有酶分子均與底物結合)，其中cE0為酶的初始濃度；,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,，稱為米氏常數(shù)，表示酶和底,物間的親和力大?。篕m越小，則親和力越大，ES越不易解離； Km與酶催化反應物系的特性及其反應條件有關，是酶催化反應性質的特性常數(shù)。,底物濃度與酶催化反應速率的關系,當cS,Km時，底物濃度低，一級反應；,當?shù)孜餄舛葹橹虚g值時，隨著cS增大反應從一級向零級過渡，為變級數(shù)過程。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,當cS,Km時，底物濃度高，零級反應；,當Km=cS時，r = rmax/2,Km數(shù)值上等于反應速率為rmax/2 時cS的值。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,米氏方程變形公式Lineweaver-Burk法（L-B法）,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,例題分析,例題（P251）：在pH為5.1及15下，測得葡萄糖淀粉酶水解麥芽糖的初速率與麥芽糖濃度的關系如下：,求：該淀粉酶水解麥芽糖反應的Km和rmax？,酶催化反應中，某些物質（外源物質、反應底物或產物等）的存在使反應速率下降，這些物質被稱作抑制劑(I, Inhibitor)，其效應稱為抑制作用。,可逆抑制：酶與抑制劑之間靠非共價鍵結合，存在解離 平衡，可通過透析等方法除去,不可逆抑制：酶與抑制劑之間靠共價鍵相結合，使活性酶 濃度降低,根據(jù)抑制機理不同，可逆抑制分為：競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制、底物抑制。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,三 有抑制作用時的酶催化反應動力學,抑制作用,1 競爭性抑制,當抑制物與底物的結構類似時，它們將競爭酶的同一可結合部位（活性位），阻礙了底物與酶相結合，導致酶催化反應速率降低。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,KI表示抑制物與酶的親和力大??；,可增加底物濃度來提高反應速率。,KmI為有競爭性抑制時的米氏常數(shù)。,其中，,1 競爭性抑制,抑制物與酶的非活性部位結合，形成抑制物酶的絡合物后再與底物結合，或者部分底物酶絡合物與抑制物結合，所形成的底物酶抑制物不能直接生成產物，導致酶催化反應速率降低。,2 非競爭性抑制,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,非競爭性抑制時的最大速率：,增加反應物濃度也不能減弱非競爭性抑制物對反應速率的影響。,2 非競爭性抑制,有些抑制劑不能直接與游離酶相結合，而只能與底物-酶絡合物相結合，形成底物酶抑制劑中間絡合物，且該絡合物不能生成產物，使酶催化反應速率下降。,3 反競爭性抑制,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,3 反競爭性抑制,酶催化反應速率隨底物濃度的升高先增大后降低，高濃度底物造成反應速率下降。底物抑制是由于多個底物分子與酶的活性中心結合，所形成的絡合物不能分解為產物所致。,4 底物抑制,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,酶催化反應速率與底物濃度關系不是雙曲函數(shù)，而是拋物線關系。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,，底物抑制時的解離常數(shù),對cS求導，令,，得,底物抑制時r-cS關系,(optimal),4 底物抑制,rmax,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.1 酶催化反應及其動力學,有/無抑制作用時的酶催化反應動力學對比,無抑制,競爭性抑制,非競爭性抑制,反競爭性抑制,底物抑制,Km,rmax,cS , 則 r？,rmax,Km,rmax,Km,Km,X,X,微生物反應(發(fā)酵過程)是利用微生物中特定的酶系進行的復雜生化反應過程。,厭氧發(fā)酵（乙醇發(fā)酵、丙酮丁醇發(fā)酵和乳酸發(fā)酵等）,通氣發(fā)酵（抗生素發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵等）,發(fā)酵產品種類,微生物細胞本身,微生物代謝產物或轉化產物,微生物酶,代謝過程本身（如廢水處理）,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,對氧氣的需求,微生物反應包括以下過程：,質量傳遞過程：營養(yǎng)物質向微生物細胞內的傳遞和代謝產物向細胞外 的傳遞；氧氣擴散與傳遞微生物細胞生長與代謝過程；微生物群體的退化與變異過程。,以代謝產物為目標產物的微生物反應過程中，生化反應速率及其影響因素：1 細胞生長速率；2 基質消耗速率；3 產物生成速率；4 氧的消耗速率。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,細胞的生長速率rx：在單位體積培養(yǎng)液中，單位時間內生成的細胞（菌體）量，即：,在給定條件下，細胞生長可以用細胞濃度變化來定量描述。,V為培養(yǎng)液體積，mx為細胞質量。對于恒容過程，細胞的生長速率可定義為：,cx為細胞濃度，常用單位體積培養(yǎng)液中所含細胞干重表示。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,一 細胞生長動力學,均衡生長類似于一級自催化反應，以細胞干重增加為基準的生長速率與細胞濃度成正比，比例系數(shù)為，即,表示單位菌體濃度的細胞生長速率，是描述細胞生長速率的一個重要參數(shù)，稱為比生長速率。比生長速率大小表示菌體增長的能力，受到菌株和各種物理化學環(huán)境因素的影響。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,在細胞間歇培養(yǎng)中的比生長速率為,cx0為起始菌體濃度。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,當細胞處于指數(shù)生長期時，一般為常數(shù)，所以,針對確定的菌株，在溫度和pH等恒定時，細胞比生長速率與限制型底物濃度的關系可以用Monod方程表示。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,細胞的生長均為均衡性生長，描述細胞生長的唯一變量是細胞濃度；培養(yǎng)基中僅有一種底物是細胞生長限制性基質，其余組分均過量， 其變化不影響細胞生長。 將細胞生長視為單一反應，且對基質的細胞收率Yx/S為常數(shù)。 Yx/S為每消耗單位質量基質所生成的細胞質量。,Monod方程假設：,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,cS為限制性基質的濃度（g/L）；max為最大比生長速率（h-1）;Ks為飽和系數(shù)（g/L），即Monod常數(shù)，其值等于最大比生長速率一半時限制性基質的濃度，是表征某種生長限制性基質與細胞生長速率間依賴關系的一個常數(shù)。,Monod方程：,，由于,得到,當cS,Ks時，,，一級動力學關系；, max，零級動力學關系。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,當cS,Ks時，,細胞比生長速率與限制性底物濃度關系,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,例題分析,例題(P259)：在全混流反應器中，以葡萄糖為限制性基質，在一定條件下培養(yǎng)曲霉sp。實驗測得不同基質濃度下曲霉sp比生長速率如下所示：,若該條件下曲霉sp生長符合Monod方程，試求該條件下的max和KS。,基質的比消耗速率qS：單位細胞濃度的基質消耗速率。,產物的比生成速率qP: 單位細胞濃度產物的生成速率。,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,二 基質消耗動力學,基質消耗速率：在單位體積培養(yǎng)基單位時間內消耗基質(碳源、氮源、氧等)的質量。以單一限制性基質消耗動力學為例：,在間歇培養(yǎng)中基質消耗速率為：,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,三 產物生成動力學,根據(jù)產物形成與細胞生長間的不同關系,發(fā)酵過程可分為型、型和型。,型：細胞生長與產物合成耦聯(lián)型，即細胞生長與產物合成直接相關連，它們之間是同步的。YP/x：單位質量細胞單位時間內產物的得率。,主要是葡萄糖代謝的初級中間產物，如乙醇、乳酸發(fā)酵等,6.2 生化反應動力學基礎,6.2.2 微生物的反應過程動力學,型：細胞生長與產物合成半耦聯(lián)型，即產物的生成與細胞的生長部分耦聯(lián)，細胞生長前期基本無產物生成，一旦有產物生成后，產物的生成速率既與細胞生長有關，又與細菌濃度有關。,(、為常數(shù)),谷氨酸發(fā)酵和檸檬酸發(fā)酵等。, 型：細胞生