【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）牛結(jié)核病多重組抗原間接ELISA試劑盒的研制及應(yīng)用預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 牛結(jié)核病 多重組抗原 間接 劑盒的研制及應(yīng)用 of it a of it a I 摘 要 為了建立一種有效的牛結(jié)核病間接 法， 本研究設(shè)計(jì)了 3 對引物，從牛分枝桿菌 菌株的基因組中 采用重疊延伸剪接技術(shù) (by 得融合基因 經(jīng)過多次亞克隆步驟后， 將 段 連于同一表達(dá)載體 )中，獲得了重組質(zhì)粒 該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 腸桿菌感受態(tài)后，經(jīng) 導(dǎo) 表達(dá) 帶有兩個(gè)六組氨酸標(biāo)簽的 融合蛋白 以 合層析的方法 純化該 融合 蛋白。 析表明該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性。 以 融合 蛋白 為包被抗原，在確定了最佳封閉液和最佳包被條件后，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀釋度， 以及 最佳一抗 、 二抗作用時(shí)間和顯色時(shí)間，建立了檢測牛結(jié)核病抗體的間接 法。 用 150 份健康牛血清 的 檢測 結(jié)果 統(tǒng)計(jì)分析后確定診斷方法的判定標(biāo)準(zhǔn)，即樣本 S/P 大于 陽性，小于 陰性，兩者之間為可疑。 通過對 85 份牛結(jié)核病血清和 100 份 無結(jié)核病牛血清 的檢測結(jié)果表明， 法的敏感 59/85），特異性為 96%（ 96/100）。對 50 份 性血清和 67 份 性血清（ 117份 ） 進(jìn)行檢測，并 與 試 進(jìn)行 比較 ， 本方法與 試診斷的 符 合率為 本研究還進(jìn)行了試劑盒的初步組裝， 并將該試劑盒應(yīng)用于現(xiàn)地血清樣品的檢測， 為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 研究 表明本 試劑盒具 有較好的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)前景。 關(guān)鍵詞： 牛結(jié)核病，融合蛋白，間接 n to an NA of NA . NA of by a +) to a It by of by to be A of to 34) of of 150 in to , .4 as .5 .4 as 5 00 59/85） 6%（ 96/100） . 117 67 of PD 0 of PD PD PD in is a of 錄 1 緒論 . 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 . 1 結(jié)核病的流行和控制 . 1 結(jié)核病診斷技術(shù)的研究進(jìn)展 . 3 結(jié)核病疫苗的研究進(jìn)展 . 5 究目的和意義 . 9 究內(nèi)容和方法 . 10 分枝桿菌抗原 . 10 . 10 2 試驗(yàn)部分 . 11 分枝桿菌抗原 融合表達(dá) . 11 料和方法 . 11 果 . 18 論 . 22 接 法的建立及試劑盒的組裝 . 22 料和方法 . 22 果 . 26 論 . 35 3 結(jié)論 .考文獻(xiàn) .錄： .錄 1：測序結(jié)果序列（ 期望序列（ 比對： . 43 致 謝 . 者 簡 歷 .國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 1 緒論 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 結(jié)核病的流行和控制 牛結(jié)核病 (主要是由牛分枝桿菌 (起的一種牛的慢性消耗性傳染病，該病可通過病畜傳染給人類或其他動物。自從 1882 年 次分離培養(yǎng)并詳細(xì)描述了結(jié)核分枝桿菌以來，人們開始 漸漸 研究和認(rèn)識 分枝桿菌（ 1882； et 2004）。 到 1898 年 ， 次將牛分枝桿菌 (M. 其它的分枝桿菌明確區(qū)分開來（ 898； et 2003）。牛分枝桿菌主要感染不同種屬的溫血?jiǎng)游铮ㄓ刑銊游?、?袋動物、食肉類動物、靈長類、鰭腳類動物和嚙齒類動物在內(nèi)的 50 多種哺乳動物，還包括類鸚鵡鳥、石鴿、北美洲烏鴉等 20 多種禽類。其中牛是最敏感的動物（ et 1995）。 人對牛結(jié)核也很敏感，且很多病例與感染動物有接觸史。由于牛和人類的關(guān)系（牛奶、牛肉及制品等）較其他動物更為密切，因此約 10%左右的人結(jié)核?。ú煌膰液偷貐^(qū)不同有不同的比例）是由牛分枝桿菌引起。牛結(jié)核病的傳染流行不僅會嚴(yán)重影響到畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，而且還威脅著人類的身心健康。因此，早在 1960 年世界衛(wèi)生組織專家委員會第七次會議 就指出：在那些還流行牛結(jié)核病的國家中，人類始終受到該病的威脅，除非消滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的。 牛結(jié)核 病 感染一般發(fā)生在不太發(fā)達(dá)的國家和發(fā)達(dá)國家的特殊人群，他們因 食用未經(jīng)巴氏消毒的奶制品而感染。人感染牛結(jié)核 病 的另一種來源是與感染動物的接觸，如屠宰場工人、獸醫(yī)和動物訓(xùn)練員。在發(fā)生該病的這些人群當(dāng)中，以飛沫形式傳播已被確認(rèn)為是最可能的感染途徑。后來，有了人結(jié)核 病 以飛沫形式傳染給動物的報(bào)道（ et 1994； et 1998； et 2005）。 呼吸道傳播是牛結(jié)核病的主要傳播途徑。吸入了被污染的飛沫或媒介是傳播牛結(jié)核病的最主要的方式 ， 只須很少量的牛分枝桿菌即可引起感染。野生動物間常以此方式傳播牛結(jié)核病，如英國的歐洲獾和新西蘭的刷尾袋鼯。 采食了被污染的飼料和飲水是另一種重要的傳播途徑。動物可通過 采 食了有傳染性的黏液、鼻汁、糞便和尿液等或食入了被污染奶牛的牛奶而經(jīng)口感染。由于牛分枝桿菌具有長時(shí)間在體外存活的能力，因此食入了被牛分枝桿菌污染的食物即可造成種間疾病的傳播。此外 ， 還有通過撕咬傳染和垂直傳播的報(bào)道（劉思國 ， 等 2005）。 目前，多數(shù)國家都不 提倡用疫苗接種的手段來控制牛結(jié)核病，而采用屠宰 試診斷陽性牛的策略（ 2001a）。許多發(fā)達(dá)國家就是利用該策略有效地控制了牛結(jié)核病。美國是世界上第一個(gè)實(shí)行根除牛結(jié)核病的國家。自 1917 年實(shí)施消滅牛結(jié)核病的計(jì)劃以來，已經(jīng)使牛結(jié)核病發(fā)病率降為 以后一直呈零星散發(fā)。美國于 1998 年實(shí)現(xiàn)了無牛結(jié)核病目標(biāo) ,。 但由于野生動物以及人類結(jié)核病的發(fā)生和流行，后來在密歇根州又有發(fā)生。所以，美國的牛群處在不斷地檢疫和高度警惕之中 (et 2000； 2003)。歐共體國 家于 20 世紀(jì) 50 年代簽署了控制牛結(jié)核病的貿(mào)易協(xié)定。北歐的丹麥、比利時(shí)、挪威、德國和荷蘭等國已基本消滅了牛結(jié)核病 ,英國和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 法國處在控制狀態(tài)。 2000 年英國提供的數(shù)據(jù)表明 ， 全國獸群中本病的發(fā)生率為 過去十幾年間英國西南部的發(fā)病率成指數(shù)上升。獾被認(rèn)為是本病在大不列顛和愛爾蘭重要的傳染源，目前正在進(jìn)行大量試驗(yàn)來評價(jià)獾在牛分枝桿菌控制中的作用 (et 006)。與英國和美國的情況相似，澳大利亞、新西蘭等國家已經(jīng)消滅了牛結(jié)核病 ， 但近年來由于野生動物獾和狐貍等動物結(jié)核病的出現(xiàn) ,致使牛又感染了 結(jié)核?。?2001a）。 近年來發(fā)現(xiàn)了很多野生貯存宿主，如新西蘭的刷尾袋鼯和海獅、英聯(lián)邦的歐洲獾、美國密歇根的白尾鹿、水牛和南非的羚羊，其他的如大象和犀牛也是牛分枝桿菌的宿主。野生動物通過排泄物將結(jié)核桿菌排出體外，污染了飼草、飼料和飲水等 ,家畜采食后感染結(jié)核桿菌，進(jìn)而造成牛結(jié)核病的發(fā)生。這是牛結(jié)核病難以消滅而持續(xù)存在的主要原因 (006)。 第三世界國家牛結(jié)核病廣泛流行，嚴(yán)重地危害著人類的健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展。亞洲和非洲是牛結(jié)核病和人類結(jié)核病的高發(fā)區(qū)。在所有的非洲國家中 ， 只有 7 個(gè) 國家考慮到牛結(jié)核病是必須申報(bào)的疾病而采取檢疫和部分撲殺政策 ， 只有 15%的結(jié)核病牛群采取檢疫和撲殺政策 ， 其余 48個(gè)國家采取的控制措施不當(dāng)或根本就沒有采取任何措施。因此，大約 85%的牛群和 82%的非洲人生活在采取部分控制措施或根本沒有采取任何控制措施的環(huán)境中。 1996南非克洛格國家公園爆發(fā)了結(jié)核病。據(jù)統(tǒng)計(jì)公園南部的水牛感染率達(dá) 42%，中部地區(qū)的感染率為 21%，該結(jié)核病的自然宿主是水牛 ,這種無種界限的相互傳播是以前沒有報(bào)道的。亞洲國家中 ， 只有 7 個(gè)國家采取檢疫和部分撲殺的控制政策 ， 并考慮進(jìn)行申報(bào) ， 其余 29 個(gè)國家只采取了部分控制政策或根本沒有采取控制措施。在亞洲國家中 ,因牛結(jié)核病感染 ,只有 6%的牛和低于 1%的水牛采取了申報(bào)檢疫和撲殺政策 ， 94%的牛和 99%的水牛采取了部分控制措施和沒有采取任何控制措施。因此 ， 大約94%的亞洲人生活在采取部分控制措施或根本沒有采取任何控制措施的環(huán)境中。由于結(jié)核病感染宿主的廣泛性，從而造成了結(jié)核病的不斷發(fā)生，給預(yù)防工作造成了很大的困難（劉思國 ,等 2005）。 隨著我國人民生活水平的不斷提高 ， 人們對健康生活的要求也迅速提高 ， 與之相一致的是乳制品需求量的急速攀升 ， 隨之帶動了奶牛業(yè) 在近幾年的迅猛發(fā)展。在這樣一種情況下 ， 我國的牛結(jié)核病疫情正在受到日益廣泛而密切的關(guān)注 （楊衛(wèi)沖， 2004） 。 1985 年和 1987 年進(jìn)行的兩次全國奶牛抽樣調(diào)查結(jié)果 ,牛結(jié)核病患病率分別為 1979 年、 1985 年和 1990 年三次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示 ， 由牛型分枝桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病所占的比例分別為 徐美英，等， 1998） 。此后未有全國性的調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見諸報(bào)道 ， 然而地方性的疫情調(diào)查顯示情況不容忽視（黃紀(jì)銓， 2000；郭海晏，等 2002；朱長光，等 1999）。 近年來 ，隨著耐藥性菌株的產(chǎn)生及個(gè)體養(yǎng)牛戶的增加，結(jié)核病的陽性檢出率在逐年上升。因此，在我國，牛結(jié)核病作為一個(gè)危害甚大的傳染病，再次引起人們的關(guān)注。在 1999 年的動物疫病病種名錄中，牛結(jié)核病被列為牛病中的二類動物疫病。牛結(jié)核病已經(jīng)給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是對奶牛的危害極其嚴(yán)重?；疾∧膛５膲勖s短，產(chǎn)奶量顯著降低，母牛常常不能懷孕，使役?；疾『笾饾u消瘦，勞動能力減弱，病牛乳汁將給人類的健康帶來了威脅。牛結(jié)核病影響著我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展和人類的健康。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 結(jié)核病診斷技術(shù)的研究進(jìn)展 核菌素皮內(nèi)試驗(yàn) 結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn) (目前被世界各國廣泛采用，并且是世界動物衛(wèi)生組織(薦的診斷牛結(jié)核病的唯一方法。但該方法有許多顯而易見的不足之處： 不能區(qū)分各型分枝桿菌，對因感染其它分枝桿菌而致敏的動物沒有特異性，在一些對牛群進(jìn)行 疫的國家或地區(qū)，不能鑒別免疫動物與感染動物； 在那些因病情嚴(yán)重而導(dǎo)致免疫反應(yīng)低下的動物易出現(xiàn)假陰性； 由于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) (滯后效應(yīng)，此方法在一段時(shí)間 (30d)內(nèi)不能重復(fù)進(jìn)行； 質(zhì)量和劑量、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及操作方法等因素均能影響檢測結(jié)果，故需嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制； 還必須在活體上試驗(yàn)，不便于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，也不能應(yīng)用于回顧性的流行病學(xué)分析。在一些國家，使用比較結(jié)核菌素試驗(yàn) (比較皮內(nèi)試驗(yàn)， 即在頸部一側(cè)的不同部位，同時(shí)注射 M. 兩種 夠提示被檢動物是 染還是非特異的 應(yīng)（ 1999；楊衛(wèi)沖， 2004）。 結(jié)核病 斷方法的研究進(jìn)展 結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)已經(jīng)不能滿足大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和牛結(jié)核病疫情進(jìn)一步控制的要求。因此， 需要一種高特異性和高敏感性的血清學(xué)診斷方法來彌補(bǔ)它的不足 。 法因其快速、簡便和成本低而受到青睞。最早，人們用 建立了 et 983)。但是有研究表明，該方法的特異性和敏感性都不能令人滿意 (et 987, 1990)。因此，牛分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的單個(gè)蛋白被純化出來用作 斷抗原，但蛋白純化步驟繁瑣、成本高而實(shí)用價(jià)值低（ et 989）。隨著牛分枝桿菌分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，包括 立了間接 法（ et 002）。這種方法較 異性有所提高，但敏感性卻更低了，而以多種抗原 雞尾酒 進(jìn)行 驗(yàn)有望提高其反應(yīng)的敏感性（ et 996）。 驗(yàn) 最早 由 于 1990 年建立 （ et 1990） ，其原理為致敏的外周血淋巴細(xì)胞（ 體外培養(yǎng)的條件下，受特異抗原 (如 激后被活化，表達(dá)并分泌 過一定的技術(shù)手段 (如 培養(yǎng)上清中的 行檢測，或者對 表達(dá)進(jìn)行定量或者半定量 (如 還可通過 術(shù)對分泌 淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù) (形成的斑點(diǎn)數(shù) )及對單個(gè)細(xì)胞分泌的 行定量 (形成的斑點(diǎn)大小 )，其結(jié)果與淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)具有很好的相關(guān)性。目前， 應(yīng)用最普遍 的是 法測定 肝素抗凝血液和 37 培養(yǎng)過夜， 或 以 者用于檢查交叉反應(yīng) )作為全血培養(yǎng)的刺激物 ， 第二天收集血漿樣品并以夾心 測 et 997） 。該 測定系統(tǒng)簡便快速，便于用作疫情監(jiān)測時(shí)大量樣品的測試。與結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)相比 , 定法不僅簡單快速，靈敏度和特異性 (尤其是后者 )高，而且由于減少了前者試驗(yàn)中操作和解釋上的主觀性，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 使結(jié)果更為客觀可靠。而且，在皮內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行后的 8內(nèi)再進(jìn)行 驗(yàn)，其靈敏度和特異性未 受 顯著影響 (分別為 85%和 93%)，因此可以作為皮內(nèi)試驗(yàn)理想的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn) (et 000)。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，用 為刺激抗原，可以大大減少交叉反應(yīng)，從而顯著提高該方法的特異性。使用 牛群進(jìn)行免疫接 種并不會影響對疫情的監(jiān)測 ， 能夠同時(shí)實(shí)施疫情監(jiān)測計(jì)劃和免疫接種計(jì)劃，所以該方法尤其適用于那些對牛群進(jìn)行 種的國家或地區(qū) (et 999； 2001b)。 牛 驗(yàn)的大范圍田間試驗(yàn)已在世界上許多國家 (包括澳大利亞、愛爾蘭、比利時(shí)、新西蘭、阿根廷、西班牙、意大利和美國 )完成，并在澳大利亞、愛爾蘭和新西蘭被批準(zhǔn)為正式試驗(yàn)。以 為抗原，該法 敏感性 約為 特異性約為 et 000）。若以 雖然 敏感性 有所下降，但是特異 性可達(dá) 2001 年 ， 報(bào)道，通過使用混合了 雞尾酒 抗原進(jìn)行刺激，可使該試驗(yàn)的特異性達(dá)到 100%。診斷上的高特異性將大大降低大規(guī)模實(shí)施 檢疫 計(jì)劃的經(jīng)濟(jì)成本，從而有利于這一計(jì)劃的大范圍推廣實(shí)施。 菌體成分的檢測 998)報(bào)道了利用薄層層析技術(shù) (通過分析 GL( 可以快速對 行檢測和鑒定。該技術(shù)只需 10細(xì)菌培養(yǎng)物，與傳統(tǒng)的生化鑒定方法相比具有簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，因而是一種可靠的替代方法。還有學(xué)者利用過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體檢測 體抗原 (如 )的免疫過氧化物酶試驗(yàn)檢測法。其優(yōu)點(diǎn)是檢測速度快、成本低、操作簡便、在檢測分枝桿菌混合感染時(shí)尤其出色；缺點(diǎn)是結(jié)果易受標(biāo)本采集和病程影響，準(zhǔn)確率比較低。 巴細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn) 致敏的外周血淋巴細(xì)胞 (特異性抗原 (如 )刺激下 ， 可使抗原特異性 T 淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生增生反應(yīng)。經(jīng)典方法使用同位素對合成 須的某種核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。最近有報(bào)道使用 55代同位素標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷。 一種胸腺嘧啶核苷的類似物 ,可取代胸腺嘧啶核苷參與 合成。被結(jié)合的 由熒光標(biāo)記抗 體識別并結(jié)合 ,配合流式細(xì)胞儀可以對其進(jìn)行識別并計(jì)數(shù)。通過測定外周血循環(huán)中的增生淋巴細(xì)胞的比例可了解淋巴細(xì)胞增生的程度 ， 間接反映淋巴細(xì)胞被特異性 抗原致敏的情況 ， 從而分析動物機(jī)體對 細(xì)胞免疫狀態(tài)。 合酶鏈反應(yīng) (術(shù) ) （ 1999）從 序列中分別選擇一段高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物對樣本進(jìn)行擴(kuò)增，由于不同分枝桿菌基因組中插入序列的不同，可以鑒別多種分枝桿菌，且結(jié)果具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 （ 2002）對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 ( 16 列設(shè)計(jì)引物，能從組織中一次檢測出這兩類分枝桿 菌。該試驗(yàn)秉承了 術(shù)高度靈敏的特性，而且通過對不同的特異區(qū)段設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，能夠鑒別各種分枝桿菌。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 （ 2003）發(fā)現(xiàn)，可以將人巨噬細(xì)胞系 細(xì)胞具有 體 ,缺乏膜表面及胞漿免疫球蛋白，易于培養(yǎng)且對 感 ,是擴(kuò)增牛 有效媒介 )用來從臨床樣本中分離和增殖分枝桿菌，經(jīng)過 48 小時(shí)培養(yǎng)可以將微量的分枝桿菌大量增殖。收集培養(yǎng)后的細(xì)胞 ,隨后可以通過半巢式 (測被感染的 胞中牛 M. 或 通過流式細(xì)胞儀檢測分子伴侶 10(0，也有人稱之為 為 特有 )的表達(dá)和分泌 ， 從而檢測 酸探針技術(shù) （ 1997）將 因組上一段長度為 165有 動子的 行放射性標(biāo)記并將其作為探針，提取待測菌株的 限制性內(nèi)切酶 消化，跡后與探針進(jìn)行雜交 。 該方法綜合利用了 的限制性酶切 片段 長度多態(tài) (術(shù)和 針技術(shù)，能夠從混合樣品中一次檢出 多種致病或非致病分枝桿菌。 （ 1997）建立了間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù) (用以檢測 是利用一段特定的間隔區(qū)寡核苷酸與體外擴(kuò)增得到的 這種雜交具有菌株特異性 ， 因而可以 同時(shí)對 各個(gè)菌株進(jìn)行快速的鑒定和鑒別 ， 還可鑒別 方法只需要少量的 并可直接利用細(xì)菌裂解物進(jìn)行試驗(yàn) ， 無需進(jìn)行細(xì)菌的傳代培養(yǎng)和提取 果分析也相當(dāng)簡便。 （ 2000）在術(shù)的基礎(chǔ)上 ， 結(jié)合運(yùn)用序列捕獲 (術(shù) (目的是富集樣本中的細(xì)菌 可以直接從組織樣本中檢測一組間隔區(qū)寡核苷酸型 (式 ， 從而可以快速檢測出 結(jié)核病疫苗的研究進(jìn)展 卡介苗（ 由 1908間發(fā)展出來的。時(shí)至今日， 是防治結(jié)核病的唯一可用疫苗 (et 2004)。但是， 免疫保護(hù)力卻并不令人滿意，因不同地區(qū)不同人群差異很大（ 0%，也缺乏統(tǒng)一的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (003)；且，環(huán)境分枝桿菌往往導(dǎo)致 et 002)；此外， 種牛無法用結(jié)核菌素 （ 驗(yàn)與自然感染牛區(qū)分（ 2001）。所以，世界各國都在致力于改進(jìn) 研制一種新型有效的結(jié)核病疫苗。 因工程重組或減毒的活疫苗 這是一類通過各種基因工程手段，發(fā)展起來的基于主要保護(hù)性抗原和活載體（ 他分枝桿菌、沙門氏菌或痘病毒）的活疫苗。 重組的卡介苗（ 多次傳代過程中，毒力下降的同時(shí)，由于抗原蛋白的編碼基因也發(fā)生突變或丟失，其抗原性也下降。針對該不足，通過質(zhì)粒等載體植入結(jié)核桿菌主要保護(hù)性抗原，使其能分泌這 些保中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 護(hù)性抗原，從而增強(qiáng) 免疫效力。重組 現(xiàn)今唯一保護(hù)力超過 可用疫苗。 一能表達(dá) 融合蛋白，其二能分泌 白。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明前者的保護(hù)力比 強(qiáng)，后者的保護(hù)力與 當(dāng) (003)。 了包含更多的抗原和具有更強(qiáng)的保護(hù)力外，它還擁有 所有優(yōu)點(diǎn)： 安全，接種發(fā)病率僅為百萬分之一。 生產(chǎn)成本低，它沒有花費(fèi)昂貴的合成和純化步驟。 能在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，穩(wěn)定地釋放各種抗原物質(zhì)。 穩(wěn)定易保存。但是， 與 樣不能用于免疫缺陷的個(gè)體，也干擾 驗(yàn) (000)。 一種很有前途的結(jié)核病疫苗。通過以下途徑還可以進(jìn)一步改進(jìn) 使用具有更強(qiáng)啟動子的載體，增加抗原的表達(dá)量。 增加抗原的種類。 改變免疫接種途徑 (003)。 使外源基因與細(xì)胞因子 融合表達(dá)或共表達(dá)。但是， 擾 驗(yàn)嚴(yán)重限制了它在牛體上的應(yīng)用。因此，還未見 于牛的報(bào)道。進(jìn)一步提高 保護(hù)力和發(fā)展新的牛結(jié)核診斷方法可望能解決這一應(yīng)用上的限制。 非致病性分枝桿菌疫苗及其作為載體的重組疫苗 尋找非致病性的分枝桿菌作為結(jié)核病的疫苗。研究較多的有母牛分枝桿菌（ 恥垢分枝桿菌（ 田鼠分枝桿菌（ 哈瓦那分枝桿菌（ 非致病性的分枝桿菌疫苗具有生長速度快和安全等優(yōu)點(diǎn)。而且它與 樣能引入外源基因構(gòu)建成重組的非致病性的分枝桿菌疫苗（呂華坤，等， 2004）。 以其他細(xì)菌或病毒為載體的重組疫苗 據(jù)報(bào)道將結(jié)核分枝桿菌 的主要保護(hù)性抗原引入減毒的沙門氏菌或痘病毒內(nèi)制成結(jié)核病疫苗。其保護(hù)力與 當(dāng)。而且，通過引入合適的抗原能設(shè)計(jì)出不干擾與 驗(yàn)的疫苗（范雄林，2001）。 減毒結(jié)核分枝桿菌疫苗和營養(yǎng)缺陷型疫苗 用基因工程的方法剔除其毒力因子或使之產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷，從而改造牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌或 為新型疫苗。 將牛分枝桿菌的 因敲除得到的突變株對豚鼠的致病力明顯減弱。而且，接種的豚鼠還不產(chǎn)生針對 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（ 可用 試區(qū) 分疫苗接種和自然感染（ 2000）。 的研究表明脯氨酸或色氨酸營養(yǎng)缺陷型結(jié)核桿菌，在 10 天之內(nèi) 90%以上被巨噬細(xì)胞殺死。在小鼠（ 內(nèi)兩者都無毒力，并且能提供相當(dāng)于（前者）或高于（后者） 保護(hù)力（ A， et 2001）。 亮氨酸營養(yǎng)缺陷型 能在小鼠體內(nèi)和培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，免疫牛不產(chǎn)生針對 et 996）。 由此可見，減毒結(jié)核分枝桿菌疫苗和營養(yǎng)缺陷型疫苗有如下優(yōu)點(diǎn)： 安全，它甚至對免疫缺中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 陷（ 體都沒有毒力。 免疫效力較強(qiáng)。 可望發(fā)展成為一種結(jié)核的標(biāo)記疫苗。 白亞單位疫苗 亞單位疫苗是由一個(gè)或多個(gè)分枝桿菌組份加上適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┒傻囊呙?。?dāng)前作為亞單位疫苗的候選分子的主要是蛋白性抗原。其中研究得最多的是培養(yǎng)濾液蛋白（ 熱休克蛋白（ 范雄林， 2001）。 結(jié)核蛋白亞單位疫苗可分為培養(yǎng)濾液蛋白（ 合物疫苗、單一蛋白亞單位疫苗、復(fù)合蛋白亞單位疫苗、融合蛋白亞單位疫苗以及表位亞單位疫苗。 培養(yǎng)濾液蛋白（ 苗在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)與 當(dāng) 的保護(hù)力。 用牛分枝桿菌 牛 合物作為疫苗免疫牛。 再 用牛分枝桿菌有毒力株攻毒。結(jié)果表明，該疫苗能夠提供優(yōu)于 保護(hù)力 (et 000)。 合物疫苗成分復(fù)雜而不確定 ,分枝桿菌生長緩慢而不易大批生產(chǎn)，而且該疫苗的免疫牛無法用 試與自然感染牛相區(qū)別 (et 002)。相比之下，單一蛋白亞單位疫苗、復(fù)合蛋白亞單位疫苗和融合蛋白亞單位疫苗則有一定的優(yōu)勢： 它是一種明確的產(chǎn)物。 縮短了生產(chǎn)周期。 由于融合蛋白亞單位疫苗是以融 合的形式產(chǎn)生的，因此其中的蛋白之間能互相增強(qiáng)免疫原性 (et 001)。 它不干擾 試診斷。 對被環(huán)境中的分枝桿菌致敏的動物同樣有效 (et 002)。 此外，表位疫苗也因其具有安全和簡單的優(yōu)點(diǎn)而受到重視。 研究了兩個(gè)來自 別表位 1氨基酸殘基（ 51氨基酸殘基（ 作為疫苗的可能性。他們發(fā)現(xiàn) 能誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。但是 ，只有 提供足夠強(qiáng)的與 當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)力。而且無論是自然感染還是疫，機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)都是針對 。這一結(jié)果表明：表位多肽可以作為抗結(jié)核的疫苗；而且具有簡單、安全、能持續(xù)誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)但不被反應(yīng)清除以及所有亞單位疫苗具備的優(yōu)點(diǎn) (et 000)。 酸疫苗 1990 年， 發(fā)現(xiàn)將細(xì)菌半乳糖苷酶基因注入肌細(xì)胞能導(dǎo)致基因細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)并合成半乳糖苷酶。 1992 年， 證明注射質(zhì)粒 激發(fā)機(jī)體 的免疫應(yīng)答。至此，核酸疫苗就宣告誕生。 我們今天所說的 苗是指將抗原的基因插入質(zhì)粒載體構(gòu)建成的重組載體；它能在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增；通過肌肉注射或基因槍等方式導(dǎo)入動物體后，能穩(wěn)定表達(dá)抗原物質(zhì)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答。 1996 年， 和 各自構(gòu)建了針對結(jié)核的 苗 (003)。從此，核酸疫苗成了結(jié)核疫苗研究中的熱門。牛結(jié)核的核酸疫苗也取得了很大的進(jìn)展。 編碼單個(gè)抗原的 苗 用分別編碼 三個(gè) 苗做牛體免疫試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn) 誘導(dǎo) 細(xì)胞分泌特異性的 明編碼 第一章 緒論 8 的 苗能夠使牛產(chǎn)生針對牛結(jié)核的細(xì)胞免疫和體液免疫。而編碼 苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)則相對較弱，編碼 苗則幾乎沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在他們的研究中還發(fā)現(xiàn)這三種 苗免疫的牛都不對結(jié)核菌素皮試產(chǎn)生反應(yīng) (et 000)。 997)等的研究發(fā)現(xiàn) 苗有免疫治療的作用。 對 苗的治療作用的機(jī)理作了探討。他們發(fā)現(xiàn)： 苗治療組小鼠的肺部有淋巴細(xì)胞浸潤； 這些浸潤的淋巴細(xì)胞中， 胞表面 表達(dá)上調(diào)；而 胞表面只有 達(dá)的上調(diào)； 見， 苗的治療作用主要是增強(qiáng)了以細(xì)胞毒作用為特征的 型細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而減少荷菌量 (et 004)。 編碼多個(gè)抗原的 苗 編碼單個(gè)的 苗保護(hù)力一般都低于 多個(gè)候選基因的聯(lián)合作用則可以提高 怡等（ 2003）構(gòu)建了分別編碼 種抗原基因的苗。將這三者混合成組合 苗再免疫小鼠。結(jié)果表明該 苗有比 好的保護(hù)力。 組合 苗在體內(nèi)表達(dá)時(shí)，可能會產(chǎn)生競爭，使得某些抗原蛋白不能得以表達(dá)。而將多個(gè)基因插入到一個(gè)載體上而成的嵌合 苗，在體內(nèi)表達(dá)融合蛋白，則可以避免這種情況。（ 2004）構(gòu)建了融合表達(dá) 苗。他們用小鼠做免疫試驗(yàn)和攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示： 結(jié)果表明在動物的不同器官融合 苗都有不同程度的表達(dá)； 融合 苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫均比 導(dǎo)的強(qiáng)； 攻毒小鼠有更高的存活率，肺部的荷菌量也更少?？梢?，融合 苗更有應(yīng)用前景。 表位 苗 （ 2004）將編碼結(jié)核分枝桿菌抗原 38白的 位 M（ 90 到 198 位氨基酸殘基）和 38（ 38白的第 166 到 175 位氨基酸殘基 ）的 段重組到 體中，構(gòu)建了表位 苗： 了觀察 S 序列（ S,泛素（ Ub,兩個(gè)表位的作用，他們還構(gòu)建了 個(gè)表位 苗。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：表位 苗能誘導(dǎo)表位特異的 答。