生物化學(xué)實驗8聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳

1、實驗八實驗八 sdssds聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)垂直板電泳分離蛋白質(zhì)一、目的要求一、目的要求1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)2.學(xué)習(xí)和掌握sds聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)二、二、原理原理電泳：帶電質(zhì)點在電場作用下，會向兩極移動；帶正電荷的移向負極，帶負電荷的移向正極，這種現(xiàn)象稱為電泳。 氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸及其衍生物等物質(zhì)都具有許多可解離的酸性和堿性基團，它們在溶液中會解離而帶電。一般說來，在堿性溶液中（即溶液的ph值大于等電點pi），分子帶負電荷，在電場中向正極移動。而在酸性溶液中，分子帶正電荷，在電場中向負極移動。移動的速度取決于帶電的多少和分子的

2、大小。不同的質(zhì)點在同一電場中泳動速度不同，常用泳動度（或遷移率）來表示。泳動度的定義是帶電質(zhì)點在單位電場強度下的泳動速度。 泳動度（或遷移率）首先取決于帶電質(zhì)點的性質(zhì)，即質(zhì)點所帶凈電荷的量、質(zhì)點的大小和質(zhì)點的形狀。一般來說，質(zhì)點所帶凈電荷越多，質(zhì)點直徑越小，越接近于球形，則在電場中的泳動速度越快；反之，則越慢。泳動度除受質(zhì)點本身性質(zhì)的影響外，還受其他外界因素的影響。影響泳動速度的主要外界因素有溶液的粘度、電場強度、溶液的ph值、溶液的離子強度、電滲現(xiàn)象類 別名 稱形 式用支持物用支持物的電泳的電泳技術(shù)技術(shù)1紙電泳紙電泳2醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳3薄層電泳薄層電泳4非凝膠支持物區(qū)帶電泳非

3、凝膠支持物區(qū)帶電泳 支持物有：淀粉、纖維素粉、支持物有：淀粉、纖維素粉、玻璃粉、硅膠、合成樹脂粉玻璃粉、硅膠、合成樹脂粉末末5凝膠支持物區(qū)帶電泳凝膠支持物區(qū)帶電泳 （1）淀粉凝膠）淀粉凝膠 （2）聚丙烯酰胺凝膠）聚丙烯酰胺凝膠 1）圓盤電泳）圓盤電泳 2）平板電泳）平板電泳 3）sds-圓盤電泳圓盤電泳 （3）瓊脂糖凝膠電泳）瓊脂糖凝膠電泳 （4）瓊脂凝膠電泳）瓊脂凝膠電泳包括常壓、高壓電包括常壓、高壓電泳泳(水平式或垂直式水平式或垂直式)水平式事垂直式水平式事垂直式(平板法、柱狀法平板法、柱狀法)垂直式垂直式(柱狀法柱狀法)垂直式或水平式垂直式或水平式垂直式垂直式(測相對分子測相對分子質(zhì)量質(zhì)

4、量)平板法或柱狀法平板法或柱狀法(如如免疫電泳免疫電泳)表表 電泳技術(shù)的種類電泳技術(shù)的種類聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱acr)和交聯(lián)劑n,n-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱bis)在加速劑n，n，n，n四甲基乙二胺(簡稱temed)和催化劑過硫酸銨(簡稱ap)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱page)。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對

5、ph和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。凝膠濃度(t)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。 表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 11

6、05 5-10 5105 2-5 核酸(rna) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。 圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(a為正面,b為剖面)(1)樣品膠ph6.7 (2)濃縮膠ph6.7 (3)分離膠ph8.9 (4)電極緩沖液ph8.3圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖1.樣品槽模板 2.長玻璃板 1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng) 返回不連續(xù)體系由電極

7、緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由ap催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為ph6.7的tris-hc1。分離膠是由ap催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為ph8.9 tris-hc1。電極緩沖液是ph8.3 tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種ph值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、ph值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。（1）樣品濃縮效應(yīng)(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及ph值的不連續(xù)性；在ph6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：hc1解離出的氯根(c1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmgg(

8、cl代表氯根，p代表蛋白質(zhì)，g代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當進入ph8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；（c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng) 圖4 電泳過程示意圖a為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子b顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。c顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。圖5 不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖 sds聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸

9、鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱sds)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可以利用sds-page測定蛋白質(zhì)分子量。在蛋白質(zhì)溶液中加入巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使蛋白質(zhì)分成單個亞單位；sds能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)sds復(fù)合物。由于sds帶有大量負電荷，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，使各種蛋白質(zhì)的sds復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷。sds與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。不同蛋白質(zhì)的sds復(fù)合物的短軸長度一樣，約為18，而長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比地變化。由于蛋白質(zhì)的遷

10、移率與蛋白質(zhì)的凈電荷量(q)成正比，與蛋白質(zhì)在溶液中的摩爾系數(shù)(f)成反比(f由介質(zhì)的粘滯性、蛋白質(zhì)分子的大小和形狀決定)，而不同的sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。三、試劑與器材三、試劑與器材試劑：10%sds、 凝膠貯液（30acr-0.8%bis)、分離膠緩沖液（3.0 mol/l ph8.9trishcl 緩沖液）、 濃縮膠緩沖液（ 0.5 mol/l ph6.7trishcl 緩沖液）、10%過硫酸銨、 10%temed、 ph8.3tris-gly電極緩沖液、 1%瓊脂糖溶液、0

11、.05考馬斯亮蘭r250 、7%醋酸器材：雙垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床五、五、 操作方法操作方法1.制備膠板前的準備 將平、凹玻璃板和邊條如下圖安裝在制膠架上。 在制膠架底部的密封槽內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住兩塊玻璃板底部間的空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)避免有氣泡。在邊條與玻璃板的縫隙的外側(cè)也滴加少量的瓊脂糖。 待瓊脂糖凝固后即可灌膠。 2 配膠表 sds不連續(xù)體系凝膠的制備 配制配制 8 8 ml ml不同濃度的分離膠不同濃度的分離膠 配制配制4 4 ml ml濃縮濃縮試劑名稱試劑名稱 所需試劑用量所需試劑用量/ml/ml 所需試劑用量所需試劑用量/ml/ml

12、7.5% 3% 7.5% 3%凝膠貯液凝膠貯液 2.002.00 0.4 0.4分離膠緩沖液分離膠緩沖液(ph8.9 tris-hcl(ph8.9 tris-hcl) ) 1.00 1.00 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液(ph6.7 tris-hcl(ph6.7 tris-hcl) ) 0.500.5010%temed10%temed 0.05 0.020.05 0.021010sds sds 0.08 0.040.08 0.04重蒸水重蒸水 4.82 3.004.82 3.00 混勻混勻后，置真空干燥器中，抽氣后，置真空干燥器中，抽氣10 min10 min10%10%過硫酸銨過硫酸銨 0.05

13、 0.040.05 0.04混勻后灌膠混勻后灌膠3. 制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細長頭的滴管或直接倒入平、凹玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1 cm。用1 ml注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約34 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。 約30-60 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細長頭的滴管或直接倒入玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5 cm處，輕輕加入樣品槽模板。靜置電泳槽，10 min左右，上膠即可聚合，再放置10-20 min。將凝膠板從制膠架中取下安裝到電泳槽上，在凹板口邊

14、緣與電泳槽之間封一些瓊脂糖。加入電極緩沖液，使液面沒過凹玻璃板約0.5 cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。 4. 樣品的處理及加樣 將樣品按0.51 mg/ml加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時迸出)，在100沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。用微量進樣器取10-30 l上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。（樣品溶解液：內(nèi)含1% sds，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍，0.01 mol/l ph6.7 tris-hcl 緩沖液） 5 .電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，接通冷卻水

15、，打開電泳儀開關(guān)，開始時電流為10 ma，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至20-30 ma，當溴酚藍染料距硅膠框1 cm時，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。6 .染色與脫色電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記。加入染色液染色1-2 h，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可觀察結(jié)果及計算相對遷移率。7. 結(jié)果處理1）觀察記錄電泳結(jié)果2）量出加樣端距溴酚蘭的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mr:相對遷移率mr= 蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)六、注意事項

16、六、注意事項（1）用瓊脂(糖)封底及灌膠時不能有氣泡，以免電泳時影響電流的通過。（2）加樣時樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。（3）如加樣孔界限不是很清晰，可在樣品梳取出前用記號筆做上記號。（4）電泳儀不能空載。（5）電泳時不要用手接觸電極緩沖液七、思考題七、思考題(1)為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蘭的作用分別是什么？ 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點等電點1 1原理原理聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectric focusing-page，簡稱ief-page)：利用各種蛋白質(zhì)pi不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrier ampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pi形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的ph梯度。在電場作用下，蛋白質(zhì)在此ph梯度凝膠中泳動，當遷移