飼料中氧化魚油和維生素E對大黃魚幼魚抗氧化能力和丙二醛殘留的影響

1、中國海洋大學(xué)本科生研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目：飼料中氧化魚油和維生素E對大黃魚幼魚抗氧化能力和丙二醛殘留的影響目 錄1 前言12. 材料與方法22.1 實(shí)驗(yàn)飼料22.2 實(shí)驗(yàn)過程32.3 樣品采集和分析32.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法43.實(shí)驗(yàn)結(jié)果43.1 魚體生化組成43.2過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）43.3肝臟丙二醛（MDA）含量44 討論513飼料中氧化魚油和維生素E對大黃魚幼魚抗氧化能力和丙二醛殘留的影響1 前言脂類在水產(chǎn)動(dòng)物生命代謝過程中具有重要的生理功能，它能提供必需脂肪酸，是組織、細(xì)胞的組成成分，為水產(chǎn)動(dòng)物提供能量，有助于脂溶性維生素的吸收和運(yùn)輸，此外還可提高某些水產(chǎn)動(dòng)物對

2、飼料蛋白質(zhì)的利用率，有效節(jié)省蛋白質(zhì)。隨著飼料中脂肪含量的升高，飼料的氧化酸敗問題已成為當(dāng)今水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中不可忽視的重要問題之一。魚油是水產(chǎn)飼料最主要的脂肪來源，故造成水產(chǎn)飼料易氧化酸敗的主要原因在于飼料中魚油的氧化。已有研究表明，魚油氧化酸敗產(chǎn)生大量具有不良?xì)馕兜娜?、酮等低分子化合物和過氧化物（徐繼林等，2005）。這些活性化合物與飼料中的蛋白質(zhì)、維生素或其他脂類作用引起飼料適口性下降、營養(yǎng)價(jià)值及消化率降低，從而導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長緩慢、免疫力和抗氧化力下降，而在飼料中添加D，L-生育酚醋酸鹽可防止上述病癥（Lewis-McCrea等, 2007; Martins等, 2007）。氧化魚油對水

3、產(chǎn)動(dòng)物造成的危害主要表現(xiàn)為：抗應(yīng)激能力下降，從而導(dǎo)致其生產(chǎn)性能下降、死亡率升高。其中抗氧化能力主要涉及動(dòng)物體參與清除體內(nèi)過多自由基的防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以分為非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)，非酶系統(tǒng)主要包括維生素E、維生素C、-胡蘿卜素、谷胱甘肽、巰基類化合物以及一些微量元素如硒、銅、鋅等；而體內(nèi)清除自由基的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(清除超氧陰離子)、過氧化氫酶(清除過氧化氫)、谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽-硫-轉(zhuǎn)移酶(清除脂質(zhì)氫過氧化物)及谷胱甘肽還原酶(維持體內(nèi)還原性谷胱甘肽的水平)等。研究表明，氧化魚油能引起魚體內(nèi)抗氧化能力的改變（Lewis-McCrea等, 2007; Martins等,

4、2007），它能消耗肝臟和肌肉等組織中的維生素E，并使魚類體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶等抗氧化酶活性發(fā)生改變，但其影響抗氧化酶活性的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。 丙二醛(MDA)被公認(rèn)為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，因此測定機(jī)體MDA含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，同時(shí)也可間接反映細(xì)胞受損傷的程度。研究表明，魚類攝食氧化魚油會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)MDA含量顯著升高，這說明氧化魚油能夠誘導(dǎo)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化。對真鯛幼魚的研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，即氧化魚油組肝臟中TBA值(MDA含量)顯著升高。以上研究均表明，外源性過氧化物的攝入會(huì)加速機(jī)體肝臟中過氧化物的生成(任澤林等，2000；葉仕根等，2006；彭士明等，20

5、07)。維生素E是具有-生育酚生物活性的所有分子的統(tǒng)稱，維生素E作為脂溶性生物組織抗氧化劑，具有保護(hù)含磷脂的生物膜的作用，它能通過抑制脂質(zhì)過氧化從而避免細(xì)胞的最終破裂。Huang等（2004）研究結(jié)果表明，雜交羅非魚幼魚(Oreochromis niloticusO. aureus)攝食含氧化魚油飼料時(shí)，維生素E的添加量對相對增重率和肝臟中谷胱甘肽含量有顯著影響，高劑量維生素E添加組的相對增重率顯著高于低劑量維生素E添加組。Lewis-McCrea等（2007）對大西洋鳙鰈(Hippoglossus hippoglossus L.)的研究也證明維生素E作為一種抗氧化劑可降低氧化魚油對魚體的損害

6、。近年來的研究主要集中在氧化魚油對對日本牙鲆（Estvez等，1997）、雜交羅非魚（Huang等，2004）、大西洋鮭（Sutton等，2006）和大西洋鳙鰈（Martins等，2007；Lewis-McCrea等，2007）生長和抗氧化能力的影響；而氧化魚油對大黃魚影響的研究未有報(bào)道。 大黃魚 (Pseudosciaena crocea R.) 屬鱸形目，石首魚科，黃魚屬，也稱黃魚、大黃花、大鮮，屬近海暖溫、集群洄游性魚類，是我國黃海南部、東海、臺(tái)灣海峽以及南海北部海水養(yǎng)殖的名貴經(jīng)濟(jì)魚類。到目前為止，有關(guān)大黃魚營養(yǎng)生理的研究己有相關(guān)報(bào)道(Mai 等，2006a、2006b；Ai 等，200

7、6a、2006b)。然而，有關(guān)氧化魚油對大黃魚抗氧化能力和丙二醛殘留的研究卻未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過在飼料中添加不同氧化程度的魚油和VE，深入分析其對大黃魚幼魚抗氧化能力和丙二醛殘留的影響，為大黃魚的營養(yǎng)生理研究和優(yōu)質(zhì)高效的人工配合飼料開發(fā)提供基礎(chǔ)資料，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康與可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。 2. 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)飼料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制作了8種飼料。所用的4種魚油是新鮮魚油（過氧化值POV=1.72 meq kg-1）和3種不同氧化程度（POV分別為28.29、62.79和104.21 meq kg-1）的氧化魚油。8種飼料是：未補(bǔ)充維生素E的飼料14，其中以新鮮魚油為對照組（飼料1），按

8、魚油的氧化程度由小到大，依次制作飼料2、3和4。補(bǔ)充維生素E（600 IUkg-1）的飼料58，其中魚油的過氧化值分別與飼料14的相對應(yīng) (表1)。新鮮魚油和氧化魚油脂肪酸組成見表4.3。實(shí)驗(yàn)采用未添加抗氧化劑的鯡魚魚油作為主要的脂肪源，氧化魚油制作方法參考Koshio 等（1994）的方法，簡言之，將魚油置于50C加熱，通入空氣氣泡并不斷攪動(dòng)，每隔4h測定一次魚油的過氧化值，直到達(dá)到特定的氧化程度，停止加熱，加入150 mg kg-1乙氧基喹啉，防治魚油進(jìn)一步氧化。實(shí)驗(yàn)飼料的原料組成和營養(yǎng)成分見表2。2.2 實(shí)驗(yàn)過程養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在浙江省寧波市象山港海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用大黃魚選用當(dāng)年人工孵

9、化的同一批魚苗，實(shí)驗(yàn)開始前在網(wǎng)箱（3.03.03.0 m）中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間投喂對照組飼料，使之逐漸適應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料、投喂時(shí)間和養(yǎng)殖環(huán)境。實(shí)驗(yàn)魚經(jīng)2周的馴化后，禁食24h，以丁香酚（110000，上海試劑廠，中國上海）麻醉，挑選出體格健壯、規(guī)格一致的大黃魚（初始體重為7.82 0.68 g），作為實(shí)驗(yàn)用魚。實(shí)驗(yàn)魚隨機(jī)養(yǎng)殖在24個(gè)海水網(wǎng)箱（1.01.01.5 m）中，每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)60尾實(shí)驗(yàn)魚。將24個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)分成8個(gè)組，投喂所對應(yīng)8種飼料。每天投喂2次（04：30和16：30），飽食投喂（以實(shí)驗(yàn)魚不再爭搶飼料為準(zhǔn)）。實(shí)驗(yàn)期間的14周飼喂小粒徑飼料，510周飼喂大粒徑飼料，每天記錄投喂量，以此計(jì)算攝

10、食率。實(shí)驗(yàn)期間水溫為26.530.5C，鹽度約為28，溶解氧約為7 mg L-1。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為期10周。2.3 樣品采集和分析養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)魚禁食24h，計(jì)數(shù)每個(gè)網(wǎng)箱中魚的尾數(shù)，以此計(jì)算存活率。稱量每個(gè)網(wǎng)箱中所有魚的重量。每網(wǎng)箱隨機(jī)取20尾魚，經(jīng)丁香酚（110000，上海試劑廠，中國上海）麻醉后，測定其體重和體長，其中5尾作為常規(guī)生化分析，-20保存待測；6尾經(jīng)尾靜脈抽血以分離出血清，解剖取其肝臟和內(nèi)臟稱重，血清和肝臟置于-70超低溫冰箱中保存待測。參照AOAC （1995）的方法，做魚體生化組成分析。魚體蛋白質(zhì)含量通過凱氏定氮法測定（N 6.25，Kjeldahl method）；脂肪采

11、用減量法，用乙醚索氏抽提；灰分采用高溫灼燒法（550）確定。脂肪酸采用氣相色譜法（GC Agilent 6890，U.S.A.），方法參照（Ai，2006a）。樣品處理：取l00mg左右真空冷凍干燥的飼料樣品，加入帶蓋試管中，然后加入3ml 1N KOH-CH3OH溶液，于75水浴25min，經(jīng)流水冷卻后，加入3 ml 2N HCL-CH3OH溶液，于75水浴25min，經(jīng)流水冷卻后，加入l ml的正己烷振蕩，然后靜置萃?。ㄟm量加水有助于分層），取上清液進(jìn)行色譜分析。組織樣品在 4下解凍，剪碎，按1：9 重量體積比(w/v)加入預(yù)冷的 50mmol/L 磷酸緩沖液（pH 值 7.4），然后勻漿

12、（均在冰上操作）。勻漿液經(jīng) 5000 r/min 離心 15min，取上清液備用。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，具體測定方法參照試劑盒的說明書。SOD活性用SOD試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）測定，其活性單位定義為：在37條件下，每毫克組織蛋白在1ml 反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位。CAT活性用CAT試劑盒測定，其活性單位定義為：每克組織蛋白中過氧化氫酶（CAT）每秒鐘分解吸光度為0.500.55的底物中的過氧化氫相對量為一個(gè)過氧化氫酶的活力單位。丙二醛MDA用 TBA 法測定（nmol mg-1 prot

13、）(Rueda-Jasso等，2004)。 組織勻漿液的蛋白含量以福林-酚試劑法測定(Lowry等，1951)。 2.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法采用Statistica 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），若差異達(dá)到顯著，進(jìn)行Duncan多重比較，顯著性水平為P0.05），但是對魚體脂肪含量產(chǎn)生了顯著的影響（P 0.05）（表4）。未補(bǔ)充維生素E時(shí)，氧化魚油處理組大黃魚體脂肪含量均低于新鮮魚油對照組。補(bǔ)充600mg kg-1維生素E時(shí)，大黃魚魚體的脂肪含量升高。新鮮魚油中補(bǔ)充維生素E的處理組（飼料5，1.72 meq kg1+VE）大黃魚的體脂肪含量最高。3.2過氧化氫酶（C

14、atalase, CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）氧化魚油和維生素E對大黃魚血清過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性造成了顯著的影響（P0.05）。未補(bǔ)充維生素E時(shí)，隨魚油過氧化值的升高，大黃魚血清CAT和SOD活性顯著升高（P 0.05）。補(bǔ)充維生素E后，新鮮魚油組大黃魚血清CAT和SOD的活性升高，而氧化魚油（28.29-104.21 meq/kg）的處理組的大黃魚血清CAT和SOD活性顯著降低（P0.05）（表5）。3.3肝臟丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量氧化魚油和維生素E對大黃魚肝臟中丙二醛的含量產(chǎn)生了

15、顯著的影響（P0.05）。未補(bǔ)充維生素E時(shí)，新鮮魚油組大黃魚肝臟丙二醛的含量最低，氧化魚油組大黃魚肝臟丙二醛含量隨著過氧化值的升高而顯著增加（P0.05）。補(bǔ)充維生素E顯著降低了肝臟丙二醛的含量（P 0.05, Duncans test）. 2 w.w.: 濕重（Wet weight）。3 S.E.M.: 平均值標(biāo)準(zhǔn)誤（Standard error of means）。4 ANOVA: 單因素方差分析（One-way analysis of variance）。表5 飼料中添加不同氧化程度的魚油和維生素E對大黃魚血清過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和肝臟丙二醛（MDA）含量的影響

16、Table 5 Catalase （CAT）, superoxide dismutase （SOD） and the liver malondialdehyde （MDA） concentration of large yellow croaker fed diets containing different levels of oxidized fish oil and vitamin E1飼料（過氧化值）Diet（POV meq kg-1）過氧化氫酶CAT超氧化物歧化酶SOD丙二醛MDA飼料1 (1.72)1.68de232.38c2.54c飼料2 （28.29）3.01c316.36ab

17、6.31b飼料3 （62.79）4.33b348.39ab7.77ab飼料4 （104.21）5.14a364.07a8.21a飼料5 （1.72VE）1.94de338.37ab2.01c飼料6 （28.29VE）1.43e308.47ab2.05c飼料7 （62.79VE）2.54c293.78b2.08c飼料8 （104.21VE）2.31cd301.17b2.11c總體標(biāo)準(zhǔn)誤Pooled S.E.M.0.1914.660.43單因素方差分析ANOVAF值（F value）29.4235.66823.050P值（P value）0.0000.0020.0001數(shù)據(jù)為三個(gè)網(wǎng)箱數(shù)據(jù)的平均值（

18、n=3）。同一列中有相同的上標(biāo)字母表示差異不顯著 （P 0.05, Duncans test）。 2 S.E.M. ：平均值標(biāo)準(zhǔn)誤（Standard error of means）。3 ANOVA：單因素方差分析（One-way analysis of variance）。 參考文獻(xiàn)：彭士明, 陳立僑, 葉金云, 龍章強(qiáng), 李二超, 王偉, 王友慧, 2007. 飼料中添加氧化魚油對黑鯛幼魚生長的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào) ,3l(增刊).任澤林, 曾虹, 霍啟光, 周文豪, 范志影, 2000. 氧化魚油對鯉肝胰臟抗氧化機(jī)能及其組織結(jié)構(gòu)的影響. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 15(4).徐繼林, 嚴(yán)小軍, 傅惠

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