細胞實驗技術(shù)及基本知識

1、For personal use only in study and research; not for commercial use.細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞周期的測定一、原理細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應(yīng)了 細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU 滲入測定細胞周期的方法。BrdU （5-澳脫氧尿喀咤核甘）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含

2、BrdU 的 DNA 將占 l/2 ，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為 兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就 可算出細胞周期的值。二、儀器、用品與試劑1 、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)2、試劑：BrdU （1.0mg/ml ）,甲醇、冰醋酸， Giemsa染液，秋水仙素，2XSSC液三、操作步驟1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU,使最終濃度為10g/ml。2、44小時加秋水仙素，使每 ml中含0.1 g。3 、 48 小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離

3、心管中。4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。5、染色體玻片置56 c水浴鍋蓋上，鋪上 2XSSC液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。6、棄去2XSSC液，流水沖洗。7 、 Giemsa 液染色 10 分鐘，流水沖洗，晾干。8 、鏡檢100 個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。9、計算：細胞周期（Tc） =48/ （ M1+2M 2+3M 3+4M 4） /100 （小時）附： （ 1 ） BrdU 配制 : BrdU 10mg 十雙蒸水10ml 4下避光保存。（2） 2XSSC配制：NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉 2H2。0.88克，加水至100ml , 4c保存。細胞

4、的凍存和復(fù)蘇一、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在130 以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-50C,細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞碉（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。二、操作步驟（一）凍存1 、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘

5、，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至 5X 106/ml左右。4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml 。5 、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。6 、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。7、按下列順序降溫：室溫- 4 c （20分鐘）-冰箱冷凍室（30分鐘）-低溫冰箱（30 C 1小時）-氣態(tài)氮（30 分鐘）液氮。注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用11.5 月。（二）復(fù)蘇1 、準備一個茶缸或1000ml 的燒壞，內(nèi)裝2/3 杯 37的溫水。2 、從液氮

6、中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1 分鐘之內(nèi)融化。3 、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。4 、 1000rpm 離心 10 分鐘，棄去上清液。5、沉淀加10ml 培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10 分鐘，棄上清液。6 、加適當培養(yǎng)基后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。三、試劑和器材器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等試劑： 0.25 胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）養(yǎng)基、 含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）附： 凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或 DSMO,使其終濃度達520%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。

7、配好后 4c下保存。細胞系或細胞株的建立一、概念1 、 細胞系 （ Cell Line） ： 原代培養(yǎng)舞經(jīng)首次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系（ Lineageof Cells ）所組成。2、細胞株（Cell Strain ）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物稱為細胞株。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細胞株（ finitecell strain ）；如果可以連續(xù)傳代，稱為連續(xù)細胞株（continuous cell strain ）。對于人類腫瘤細胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，

8、并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。二、建立細胞系（或株）的要求什么樣的體外培養(yǎng)群可被認可為己鑒定的細胞，視具體情況而定，無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)的細胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可，如用做長期培養(yǎng)，特別是反復(fù)傳代的細胞，常需做如下說明：1 、組織來源：細胞供體所屬物種，來自人體或者動物；個體性別、年齡；取材的器官或組織。如系腫瘤組織，應(yīng)說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。2 、細胞生物學(xué)檢測：了解細胞一般和特殊的生物學(xué)性狀，如細胞一般形態(tài)，特異結(jié)構(gòu)，細胞生長曲線和分裂指數(shù)，倍增時間，接種率等。如為腫瘤細胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對正常

9、組織侵潤力等實驗。3 、培養(yǎng)條件和方法；應(yīng)說明細胞系（或株）適應(yīng)的生存環(huán)境，即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH 值。三、若干細胞建株的要點及基本過程（一）腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)要點1 、取材：材料主要來源于外科手術(shù)或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。2 、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞，培養(yǎng)時能與瘤細胞同時生長，并常壓過癌細胞，導(dǎo)致癌細胞生長受阻以至消失，應(yīng)仔細排除。排除方法常有：機械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、

10、膠原酶消化法等。3 、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率根據(jù)實驗經(jīng)驗，腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養(yǎng)后，要經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據(jù)細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。（二）人類淋巴母細胞建株方法l 、 4ml 肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640 。2 、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml 淋巴細胞分離液的液面上靜置30min 。3 、 1500rpm ， 1

11、5min ，吸取白細胞層（第二層）于另一離心管中。4 、加 RPMI 1640 5ml 洗滌白細胞兩次。5、將白細胞接種至 1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入 10科l環(huán)胞霉素和100 “的EBV （ EB病毒）液，混勻。6 、水浴搖床，40 次 /分，37，3hr。7、1500rpm , 15min。將細胞接種至1ml培養(yǎng)基中（內(nèi)含谷氨酰胺 1mM/ml）加入10“環(huán)胞霉素，輕輕混勻，37 培養(yǎng)。8 、 5 天后觀察細胞轉(zhuǎn)化和生長情況，決定是否半量換液。一般半量換液l 2 次，并維持環(huán)胞霉素的濃度。9 、待轉(zhuǎn)化細胞數(shù)量明顯上升，并出現(xiàn)細胞團塊后，可轉(zhuǎn)入25ml 細胞培養(yǎng)瓶中，加1 2m

12、l 培養(yǎng)基，37培養(yǎng)10 15 天，一般每隔3 4 天觀察一次，決定是否換液，傳代。10 、細胞生長達一定數(shù)量后凍存，凍存前應(yīng)進行核型分析和存檔。個別組織細胞的培養(yǎng)體內(nèi)組織細胞在體外培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個別組織細胞培養(yǎng)的要點如下:一、上皮細胞培養(yǎng)上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長

13、生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以 3T3 細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、 Ca2+ 含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫1981 ）1 、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5 1 平方厘米小塊。2 、置0.02%EDTA 中，室溫，5 分鐘。3 、換入 0.25% 胰蛋白酶中，4 過夜。4 、分離：取出皮塊，用血

14、管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。5 、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25% 胰酶中，37，30 60 分鐘。6 、反復(fù)吹打，制成懸液。7 、培養(yǎng)：用80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。二、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)內(nèi)皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞，對于研究內(nèi)皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（ TAF） 等有很大價值。研究人內(nèi)皮細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：1 、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10 15 厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12 小時內(nèi)保存于4 。2 、用三通注射器吸取溫PBS 液

15、注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1% 的粗制膠原酶，充滿血管，消化3 10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。4、吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。5、離心去上清，加入RPMI1640 培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。三、神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)神經(jīng)細胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠

16、質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS 病毒和SV4 等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。養(yǎng)方法如下：1 、從手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks 液中漂洗一、二次。2 、置于30 50 倍體積的Hanks 液中，此時腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細胞懸液。3 、把懸液注入離心管室溫中直立5 10 分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其

17、它碎塊并獲較多細胞成分。4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)成紗布過濾，計數(shù)并調(diào)整細胞密度。5 、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO 2 溫箱中培養(yǎng)。該細胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見細胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態(tài)。細胞傳代可以0.25% 胰酶消化處理。四、肌組織培養(yǎng)各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實用。（）骨骼肌細胞培養(yǎng)1 、出生 1 一 2 天的乳鼠，引頸處死。2、無菌取大腿肌組織，切成0.3 一 0.5cm 2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks 液配的 0.25% 胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。3 、計數(shù)調(diào)整細胞密度。4、快接種

18、量2 X 106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。5 、培養(yǎng)基內(nèi)含10% 小牛血清，可加1% 的胎汁以促進分化。接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用Hanks 液配成 0.01% 明膠。該細胞接種率約50% ，細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50 52 小時后出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。（二）心肌細胞培養(yǎng)心肌細胞是最早的培養(yǎng)材料，Carrel 曾長期培養(yǎng)過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物，最常用的是雞胚心肌。心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌

19、呈紡錘形，培養(yǎng)成功時，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。五、巨噬細胞培養(yǎng)巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2 3 周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P338D 1、 S774A.1 、 RAW309Cr.l 等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，其法如下：1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml （勿注入腸內(nèi)

20、?。?，以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。2 、引頸處死小鼠。3、手提鼠尾將其全浸入70% 乙醇中3 5 秒。4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。5 、用70% 酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle 液注入腹腔中，同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。8、4 c下250g離心10分鐘后，去上清，力口 10ml Eagle 培養(yǎng)基。9、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20 30X 106細胞，其中90%為巨噬細胞。10、以3

21、X105個貼附細胞/平方厘米接種。11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用 Eagle液沖洗1 一 2次，再加新Eagle培 養(yǎng)液置CO2溫箱中。六、腎小球分離、移植培養(yǎng)SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡12分鐘，2次，置超凈臺內(nèi)，打開腹腔取出腎臟剪碎， 置含Hank' s液的無菌培養(yǎng)皿洗滌， 置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng)，濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至 120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過，去小組織塊，濾過物吸至 200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過，Hank's液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小

22、球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37c消化20分鐘，加血清終止胰酶反應(yīng)，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個/cm2,加培養(yǎng)基510ml （培養(yǎng)基組成：F123T3上清1:1; 5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島 素5（ig/ml; 25ng/ml氫化可白松；5科g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml ; D-繳氨酸 150ng/ml ）腎小球培養(yǎng)810天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，形態(tài)學(xué)觀察：細胞生長成單層多角型細胞，直徑約 100 m。七、裸小鼠移植瘤單細胞分離培養(yǎng)無菌條件下

23、取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm 3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化 30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化58分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加 一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終 止酶消化方法同上。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細胞。二.細胞培養(yǎng)的基本內(nèi)容常用設(shè)備準備室的設(shè)備：單蒸儲水蒸儲器、雙蒸儲水蒸儲器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物 品）、包裝臺。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液 PH值）、磁力攪拌器（配

24、置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80C）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、 4c冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。無菌操作無菌室的滅菌：3 %o來蘇爾或者新潔爾火或1 .定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用 者0.5%過氧乙酸擦拭。2 .CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用 3%。新潔爾滅擦拭，然后用 75%酒精擦拭或者0.5%過氧乙酸，再用紫外燈照射3 .實驗前滅菌

25、：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4 .實驗后滅菌：用75%酒精（3%。新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。實驗人員的無菌準備：1 .肥皂洗手。2 .穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3 .用75%酒精棉球擦凈雙手。無菌操作的演示：1 .凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面2 .靠近酒精燈火焰操作。3 .器皿使用前必須過火滅菌4 .繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。5 .各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6 .吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸

26、管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：1 .自來水刷洗，除去灰塵。2 .烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀鹽酸 中12小時以除去臟物、鉛、神等物。3 .刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。4 .泡酸、清洗：用清潔液（ 重泡酸鉀120g：濃硫酸 200ml：蒸僚水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿 用自來水沖洗15次，最后蒸儲水沖洗 3-5次和用雙蒸水過 3次。5 .烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。6 .高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當蒸氣

27、成直線上升時，關(guān)閉安全閥，當指 針指向15磅時，維持20-30分鐘。7 .高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：1 .刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用 清水刷洗干凈，然后烘干。2 .泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸儲水沖洗3次。3 .烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。4 .高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸 氣

28、成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥， 氣壓表指數(shù)隨之上升，當指針指向15磅時，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持 20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）5 .烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸儲水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸儲水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不 同品質(zhì)進行如下的處理程序：1 .針式濾器帽不能泡

29、酸液，用NaOH包6-12小時，或者煮沸20分鐘，在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊。2 .膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸 30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸儲水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。3 .膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30分鐘，再用自來水，蒸儲水，三蒸水洗凈，烘

30、干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。4 .膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。5 .塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：6 .其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70%酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周時間洗除殘留的氧化乙烯。用 20000100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密 寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們

31、是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆 （CoC12 6屋o）2g , 30%鹽酸10m1,蒸儲水88m1。注意事項：1 .嚴格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸儲水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使 空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。2 .安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。3 .注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。細胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑

32、：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素 .純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。具體步驟：一.水的制備：細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二.PBS的制備與消毒（也可用于其它 BSS,如：Hanks, D-Hanks液的配制）：1 .溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g , KCl 0.2g , NkHPO. H2O 1.56g, KHPO 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃 棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml,搖勻即成新配制的 PBS溶液。2 .移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將 PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)

33、，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸儲水補充蒸發(fā)掉的水份。三.胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在 pH為8.0、溫度為37c時，胰酶溶液的作用能力最強。使 用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2?？谘?、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+勺BSS,如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。1 .稱

34、取胰蛋白酶：按胰蛋白酶?濃度為 0.25 %,用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需 要調(diào)PH到7.2左右）或PBS （D-hanks）液中。攪拌混勻，置于 4 c內(nèi)過夜。2 .用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20 C保存以備使用。四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒1 .所用純凈水（雙蒸水）需要 15磅高壓20分鐘滅菌。2 .具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20萬單位。3 .使用時溶入培養(yǎng)液中，使青

35、鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位=1微克？五 .RPMI1640 的制備與消毒：1. 溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋 2-3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中）, 充分攪拌至粉劑全部溶解, 并按照包裝說明添加一定的藥品. 然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各 0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH PH到7.2左右。最后定容至 1000ml,搖勻。2. 安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別 用布包好待消毒。3. 抽濾：

36、配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。4. 分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4冰箱內(nèi)待用。5. 使用前要向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml 谷氨酰胺溶液（4時兩周有效）。六血清的滅火：細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56 水浴中滅火30 分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。七 .HEPES 溶液：HEPES勺化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N -a-hydroxythylpiperazine-N ' - ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH 范圍。使用終濃度為10-50

37、mmol/L ，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達至ij緩沖能力。1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：準確稱取HEPTS 238.3g,加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后 4c保存。注意：因為現(xiàn)在市售 HEPES1 10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES勺終濃度仍然為20m mol/L。如：稱取4.766克HEPE潞于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（ 20ml）加入1L培養(yǎng) 液中，或者每100ml 培養(yǎng)液中加入2ml 即可。八 . 谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，

38、谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4 下放置1 周可分解50，故應(yīng)單獨配制，置于-20 冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2 周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20 保存，使用時可向 100ml 培養(yǎng)液中加入1ml 谷氨酰胺溶液。九 . 肝素溶液的配

39、制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml 。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56 克 /瓶，配制時，可將其溶于100ml 三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為 C 。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml）即可。十.I型膠原酶:0.1 % I型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為I型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml 小瓶 -20 保存。十一 . 明膠溶液：因為明膠難于過濾，所以配制 0.1 %明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中

40、必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1 克（配成100ml 溶液）即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01. 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml 小瓶中，4 保存。其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml 內(nèi)皮生長因子，注意事項：1. 配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。2. 安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45 微米 和 0.22 微米濾膜各一張，放置位置為0.45 的位于 0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。3. 配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2 ,可在配制時調(diào)

41、PH至7.4。細胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：一 . 傳代前準備：1 . 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2 .用 75酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。3 .正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4 .點燃酒精燈：注意火焰不能太小。5 .準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8 分鐘再次消毒。6 .取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。7 .從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。8 .打

42、開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。二 .胰蛋白酶消化；1 .加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS 清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37。2 . 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化 適度。3 .吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。三 .吹打分散細胞：1 . 吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。2 .吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml 離心管中。3 .平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn) /分鐘

43、離心6-8 分鐘。4 . 棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml 培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。四 .分裝稀釋細胞：1 .分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3 個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。2 .顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于 5X 105/mL最后要做好標記。五 .繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2 小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25時為一個，占50為，占75時為。傳代細胞培養(yǎng)注意事項：1 .嚴格的無菌操作2 .適

44、度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注 意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附： EDTA （ 0.02乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0.20g ， NaCl 8.00g ， KCl 0.20g ， KH 2PO4 0.02g， 葡萄糖2.00g， 0.5酚紅4ml， 加入蒸餾水定容至1000ml。10 磅 20min 高壓滅菌，使用時調(diào)節(jié)PH 值到7.4。注意EDTA 不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時細胞容易脫壁。細胞的復(fù)蘇細胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在

45、-196 液氮中的細胞快速融化至37，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。具體操作一 . 實驗前準備：1 . 將水浴鍋預(yù)熱至372 .用75酒精擦拭紫外線照射30min 的超凈工作臺臺面。3 .在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。二取出凍存管：1 .根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。2 .從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。三迅速解凍：1 .迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。2 .約 1-2min 后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存

46、管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。四 .平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心 3min五 .制備細胞懸液：1 . 吸棄上清液。2 .向離心管內(nèi)加入10ml 培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。六 .細胞計數(shù)：細胞濃度以5X 105/ml為宜。七 .培養(yǎng)細胞將復(fù)合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37和5 CO 2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4 小時 （或者 24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。初學(xué)者易犯錯誤：1 水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37。2 .水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。3 .離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機損壞和細胞丟失。4 .一次復(fù)

47、蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細胞交叉污染。細胞計數(shù)實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。具體操作：.準備工作：取一瓶傳代的細胞，按照傳代細胞培養(yǎng)（消化法）中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。二 .細胞懸液制備：細胞懸液的制備方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或 Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。三 .細胞計數(shù)：1. 蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。2 .制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸5 滴細胞懸液到一離心管中，加入5 滴臺盼藍染液（0.4）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加