染色體與DNA3

1、DNA的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性本節(jié)學(xué)習(xí)重點本節(jié)學(xué)習(xí)重點 DNA變性曲線，包括增色效應(yīng)、減色效應(yīng)變性曲線，包括增色效應(yīng)、減色效應(yīng)、 Tm及其影響因素及其影響因素 DNA復(fù)性曲線，包括影響復(fù)性的諸多因素復(fù)性曲線，包括影響復(fù)性的諸多因素和和 C0t(1/2)一、一、DNA分子的變性分子的變性 1、變性（、變性（denaturation 或或 融解融解 melting）：）：DNA雙螺旋區(qū)的雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂氫鍵斷裂，使雙螺旋的兩條鏈完全分開，使雙螺旋的兩條鏈完全分開變成單鏈，這一鏈分離的過程叫做變性。變成單鏈，這一鏈分離的過程叫做變性。條件：加熱，高條件：加熱，高pH，有機溶劑（，有機溶劑（ 尿素、

2、尿素、 酰胺酰胺 )，低鹽濃度等，低鹽濃度等 熔液黏度降低熔液黏度降低 沉降速度加大沉降速度加大 浮力密度上升浮力密度上升 此外吸收值升高（此外吸收值升高（A260nm），即），即增色效應(yīng)增色效應(yīng) 指在指在DNA變性的過程中，它在變性的過程中，它在260nm的吸收值先是緩慢的吸收值先是緩慢 上升，達到某一溫度時及驟然上升。上升，達到某一溫度時及驟然上升。 單一核苷酸的光吸收值最大，其實是單鏈單一核苷酸的光吸收值最大，其實是單鏈DNA 或或RNA，雙，雙鏈鏈DNA最小，這是由于最小，這是由于堿基在疏水環(huán)境中的堆積堿基在疏水環(huán)境中的堆積所造成的。所造成的。即雙鏈即雙鏈DNA相對于單鏈相對于單鏈DN

3、A是減色的（是減色的（hypochromic），反），反之單鏈之單鏈DNA 相對于雙鏈相對于雙鏈DNA 是增色的（是增色的（hyperchromic）。）。1.1851.01.37OD Tm = of Ct = C0/2 = OD增加值的中點溫度增加值的中點溫度或或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度Tm是是DNA的（的（G+C）含量的函數(shù)。）含量的函數(shù)。熔解曲線與熔解曲線與Tm值值 核酸在260nm處的光吸收可用于測定其濃度。當(dāng)濃度為1mg/ml、光程為1cm時，雙鏈DNA 的A260=20，RNA和單鏈DNA的A260=25。 OD260/OD280可用于測定DNA純

4、度。 OD260/OD280 =1.8為純dsDNA， 純RNA為2.0，蛋白小于1（一般是0.5）。2、 常用的變性方法常用的變性方法 熱變性熱變性 堿變性堿變性應(yīng)用廣泛，特別是用于變性動力學(xué)研究應(yīng)用廣泛，特別是用于變性動力學(xué)研究 缺點：高溫引起缺點：高溫引起磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵的斷裂，得到長短不一的單鏈的斷裂，得到長短不一的單鏈pH11.3時，全部時，全部氫鍵氫鍵被淘汰被淘汰無熱變性的缺點，為制備單鏈無熱變性的缺點，為制備單鏈DNA的首選方法的首選方法 保存單鏈保存單鏈DNA的條件的條件 保持保持pH大于大于11.3 鹽濃度低于鹽濃度低于0.01mol/LD.S DNAS.S DNADen

5、aturation Renaturation 復(fù)性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞復(fù)性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞 二、二、DNA分子的復(fù)性分子的復(fù)性 （anneal or renaturation） 概念：變性概念：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的鏈又可以在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的鏈又可以 重新地合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程（退火）重新地合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程（退火）復(fù)性復(fù)性DNA分子不一定是原有的一對互補鏈分子不一定是原有的一對互補鏈 1、 影響影響DNA復(fù)性過程的因素復(fù)性過程的因素 ： 陽離子濃度陽離子濃度 0.18 0.2M Na+ 可消除靜電斥力可消除靜電斥力 復(fù)性反應(yīng)的溫度復(fù)性反應(yīng)的

6、溫度 低于低于Tm值值 25左右左右 (60-65) S.S. DNA 的初始濃度的初始濃度 C0DNA分子中，堿基排列情況（重復(fù)序列、單一序列）分子中，堿基排列情況（重復(fù)序列、單一序列） S.S. DNA分子的長度（片段的大?。┓肿拥拈L度（片段的大小）S.S. DNA愈長愈長S.S. DNA愈短愈短 分子擴散愈慢分子擴散愈慢 復(fù)性愈慢復(fù)性愈慢 分子擴散愈快分子擴散愈快 復(fù)性愈快復(fù)性愈快3-ATCTATGCTGTCAT-55-TAGATACGACAGTA-35-TAGATACGACAGTA-33-ATCTATGCTGTCAT-53-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-33

7、-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-35-TATATATATATA-33-ATATATATATAT-53-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-3二、二、C0t曲線復(fù)性動力學(xué)曲線曲線復(fù)性動力學(xué)曲線 遵循二級反應(yīng)動力學(xué)遵循二級反應(yīng)動力學(xué)dCt / dt = -KC02 反應(yīng)初始反應(yīng)初始 t = 0 單鏈單鏈DNA的隨機碰撞的隨機碰撞 過程（過程（ randomly collision ）單鏈單鏈 DNA濃度濃度 = C0反應(yīng)達反應(yīng)達 t 時時單鏈單鏈DNA濃度濃度 = CtK復(fù)性速度常數(shù)復(fù)性速度常數(shù) dCt / dt = -KC02 積分積分 Ct /

8、 C0 = 1 / (1+KC0t )當(dāng)當(dāng) Ct / C0 = 1/2 時時Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2)K = 1 / Cot(1/2)Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) Ct/C0是是C0t的函數(shù)的函數(shù)按此公式作圖得按此公式作圖得C0t曲線曲線 C0t(1/2)值對值對DNA具有特具有特征性，其中與基因組大征性，其中與基因組大?。ㄐ。―NA堿基對數(shù)）成堿基對數(shù)）成正相關(guān)正相關(guān)Ct/C0 0101C0t(1/2) C0t(1/2) Fraction reassociated1CtCo復(fù)性動力學(xué)曲線（單鏈所占比例、雙鏈所占比例）復(fù)性動

9、力學(xué)曲線（單鏈所占比例、雙鏈所占比例）在控制反應(yīng)條件相同的前提下在控制反應(yīng)條件相同的前提下, 兩種兩種DNA分子的分子的C0t(1/2)值取決值取決于于DNA序列復(fù)雜度，即最長的沒有重復(fù)序列的核苷酸序列數(shù)）序列復(fù)雜度，即最長的沒有重復(fù)序列的核苷酸序列數(shù)）( 復(fù)性動力學(xué)的復(fù)雜性復(fù)性動力學(xué)的復(fù)雜性, Kinetic complexity, K.C ) K.CKC0t(1/2) K= 5 105 AAAAAAAA K.C = 1 C0t(1/2) = 210-6ATCGATCGATCG K.C= 4 K.C = 5 105 C0t(1/2) = 1復(fù)雜性復(fù)雜性 因此因此C0t曲線提供了一種測定曲線提供了一種測定DNA分子量的分子量的方法方法 同時也能解釋單一來源的同時也能解釋單一來源的DNA所具有的不所