實驗六堿法提取質(zhì)粒

1、實驗六實驗六 堿法提取質(zhì)粒堿法提取質(zhì)粒 轉(zhuǎn)到目錄目目 錄錄 返回標題 n一目的n二原理n附：原理示意圖n三試劑n四器材n五注意事項 n六操作步驟 1 n六操作步驟 2 n六操作步驟 3nGFPuv質(zhì)粒的信息圖片nGFPuv vectors DescriptionnLocation of features 1nLocation of features 2nLocation of features 3nLocation of features 4nVectors Primer LocationnPropagation in E. coli一目的一目的n了解提取質(zhì)粒的原理。n學習和掌握質(zhì)粒提取的方法

2、和技術(shù)。三個基本步驟：n細菌的生長和質(zhì)粒的擴增n菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離n質(zhì)粒DNA的純化n返回目錄n返回目錄二原理二原理n 質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子，它能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞一些表型。質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介，這種基因的運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基體的實驗技術(shù)。n 質(zhì)粒的提取是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA分子大小不同和性質(zhì)的差異性進行的。染色體DNA比質(zhì)粒DNA大得多，且是線狀分子易斷，經(jīng)加熱或堿處理后容易變性并產(chǎn)生沉淀，即使冷卻或堿性被中和后也不可能復性，與變性蛋白質(zhì)及細胞碎片一起沉淀析出。質(zhì)粒

3、DNA是共價結(jié)合的環(huán)狀分子，不會因加熱或堿處理等被折開，加熱冷卻或恢復中性PH后又呈天然構(gòu)型，溶解在溶液中。這樣通過加熱或堿處理后又中和PH，再用離心的方法就可把質(zhì)粒DNA提取出來。n原理示意圖n返回目錄原理示意圖 返回目錄 返回原理三試劑三試劑n1. LB培養(yǎng)基 detailn2. STE detail n3. 溶液 I detailn4. 溶液 detailn5. 溶液III detailn6.3M乙酸鈉(pH5.2) detailn7. TE(pH8.0) detail n返回目錄 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 back n配制1升培養(yǎng)基，應在950ml去離子水中加入：n細菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(ba

4、cto-tryptone) 10gn細菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gnNaCl10gn搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/L NaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入去離子水至總體積為1L，15 lbf/in2(1.034105Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鐘。STE back n0.1mol/L NaCl10mmol/L TrisCl (pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)在15 lbf/in2(1.034105Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鐘。溶液溶液 I backn50 mmol/L 葡萄糖n25 mmol/L TrisCl (pH8.

5、0)n10 mmol/L EDTA (pH8.0)n在10 lbf/in2(6.895104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4。 溶液溶液 II backn0.2 mol/ L NaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)n1% SDS溶液溶液 III backn5mol/L 乙酸鉀60mln冰乙酸11.5mln水28.5mln所配成的溶液重鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。3M乙酸鈉(pH5.2） backn在800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)n在800ml

6、水中加入 186.1g EDTA-Na2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0 (約20g NaOH顆粒)，然后定容至1 L，分裝后高壓滅菌。1 mol/L TrisCl (pH8.0)n在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0 ，定容至1 L，分裝后高壓滅菌。TE(pH8.0) backn10 mmol/L TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)50TAEn242g Tris 堿n57.1 冰乙酸n100ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)1TAEn0.04 mo

7、l/L Tris-乙酸n0.001 mol/L EDTA (pH 8.0)四四器材器材n1. 恒溫搖床n2. 超凈工作臺n3. 離心機n4. 電泳儀和電泳槽n5. 玻璃器皿與耗材 n量筒、三角瓶、平皿; nEP管(1.5ml, 0.5ml); n槍頭(1ml, 0.2ml, 10l); n牛皮紙、紗布、牙簽等n返回目錄五操作步驟五操作步驟 1 1.挑選一個單菌落，接種到含適當抗生素的3ml LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)1416小時。2.取1.2 ml菌液，12,000rpm離心1分鐘，收集菌體。3.加入500l1ml STE buffer，渦旋打勻，12,000rpm離心1分鐘，收集菌體。4.加

8、入預冷的溶液I 100l，渦旋振蕩充分懸浮，分散，混勻，冰浴5分鐘 (重懸細胞)。5.加入200l溶液(現(xiàn)配)，快速輕柔顛倒幾次，直至溶液澄清，保持冰浴 (堿變性染色體DNA、蛋白質(zhì))。6.在5分鐘內(nèi)，加入溶液III 150l，輕柔顛倒510次，冰浴10分鐘 （利用pH差異，復性質(zhì)粒DNA）7.返回目錄五操作步驟五操作步驟 2 8.12,000rpm離心10分鐘，沉淀染色體DNA，及不溶的變性蛋白，取上清。9.上清液用Tris-HCl飽和苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提1-2次，每次劇烈振蕩20秒，12,000rpm 離心5分鐘，可見溶液分三層，上層為質(zhì)粒DNA溶液，中層為蛋白層，下層

9、為酚層。10.上清液用氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm離心10分鐘。11.上清液加入1/10體積 3M NaAc，2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置10-15分鐘。12.在12,000rpm離心10分鐘得到質(zhì)粒DNA沉淀。返回目錄五操作步驟五操作步驟 3 16.去上清，加入1ml 75%乙醇，洗滌沉淀。17.12,000rpm 離心10分鐘。18.去上清，吸出痕量剩余乙醇，風干。19.加入3050l ddH2O或TE（pH 8.0），溶解質(zhì)粒。20.加入RNaseA使終濃度為20g/ml，室溫放置30分鐘1小時。21.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提質(zhì)粒DNA純度及濃度。22.取

10、1-5l DNA樣品，加水稀釋至1ml，混勻后轉(zhuǎn)入 分光光度計的石英比色杯中，測定 OD260及OD280，并計算OD260/ OD280比值和DNA濃度： DNA濃度濃度= OD260稀稀釋釋倍數(shù)倍數(shù)50/1000 50/1000 （ g / l ）返回目錄分次收集4ml菌液離心，留沉淀五操作步驟五操作步驟 4 瓊脂糖（瓊脂糖（1%）凝膠電泳）凝膠電泳1.稱取一定量瓊脂糖凝膠，按1g中100ml的量加入1TAE，微波爐中加熱約2min，使瓊脂糖溶解；2.溶液冷至60 ，加入 EB至終濃度為0.5g/ml，混勻，注意戴手套操作；3.將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為0.3-0.5cm，迅速插

11、上梳子，檢查有無氣泡；4.待凝膠完全凝固后（約30min），小心取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入1TAE電泳buffer，讓液面高出膠面1mm；5.在DNA樣品中加入1/6 loading buffer，混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓降選擇為1-5V/cm （長度以兩個電極之間的距離計算）；6.根據(jù)指示劑的位置，判斷是否終止電泳。n返回目錄pGFP pBSK M六六注意事項注意事項 為提高質(zhì)粒產(chǎn)量，要注意下面兩個步驟：n加入溶液I 后，渦旋振蕩應充分打散菌體使之均勻懸浮；n加溶液II裂解要完全(快速輕柔顛倒510次) ，使蛋白質(zhì)和核酸變性；n加溶液III后PH要達到中性(輕柔振

12、蕩510次 )，使質(zhì)粒DNA復性，這樣才能使質(zhì)粒DNA與染色體DNA完全分開，否則，難分開，所以裂解和復性這兩步要從嚴掌握。n返回目錄周四：熟悉實驗原理及步驟，清洗三角瓶、量筒等器皿，裝槍頭，1.5 / 0.5 ml離心管，裝牙簽及配溶液等 50TAE :500 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0):500 ml 1mol/L Tris.Cl (pH8.0):500 ml 0.1mol/L CaCl2:500 ml ddH2O: 每組100 ml 5 mol/L NaOH: 100 ml 配LB培養(yǎng)基 液體：全班1000 ml150 ml4 瓶（Amp+）( 終濃度為60g/ml

13、)，用于兩個質(zhì)粒的接種100 ml 4瓶(Amp-)，留做感受態(tài)細胞 固體（含1.5%瓊脂粉）：每組100 ml，共1500ml，可一起配再分裝每組倒5個平板（ Amp+），用于次周轉(zhuǎn)化滅菌。七七實驗安排實驗安排周五：n用Kit 提取質(zhì)粒DNA，倒瓊脂糖凝膠板（1%），進行瓊脂糖凝膠電泳和濃度測定n每人分別提取pGFPuv、pBSK質(zhì)粒 各一管，每管60ln取1-2l電泳， 1-5l用dd H2O稀釋后 在紫外分光光度計下測 OD260及OD280，并計算濃度n對質(zhì)粒酶切過夜周六：n酶切樣品瓊脂糖凝膠（1%）電泳n用Kit對酶切后的DNA（ pBSK 大片段和GFP基因片段）片段進行膠回收n每

14、組用一個柱子回收n電泳檢測膠回收情況，用紫外檢測回收 DNA的濃度后，存放于-20冰箱中七實驗安排七實驗安排-續(xù)續(xù)GFPuv質(zhì)粒的信息圖片n返回目錄GFPuv vectors DescriptionnpGFPuv carries the “cycle 3” variant of GFP described by Crameri et al. (1). This gene was cloned between the two MCSs of the pUC19 derivative pPD16.43 (2). The GFPuv gene can be easily excised from p

15、GFPuv. Alternatively, the GFPuv coding sequence can be amplified by PCR. The GFPuv gene was inserted in frame with the lacZ initiation codon from pUC19 so that a b-galactosidase-GFPuv fusion protein is expressed from the lac promoter in E. coli . Note, however, that if you excise the GFPuv coding se

16、quence using a restriction site in the 5 MCS, the resulting fragment will encode the native (i.e., non-fusion) GFPuv protein. The pUC backbone of pGFPuv provides a high copy number origin of replication and ampicillin resistance gene for propagation in E. coli.n返回目錄GFPuv vectors Location of features

17、 1 lac promoter: 95178 CAP binding site: 111124 35 region: 143148; 10 region: 167172 Transcription start point: 179 lac operator: 179199 lacZ-GFPuv fusion protein expressed in E. coli Ribosome binding site: 206209 Start codon (ATG): 217219; Stop codon: 10031005 5 MCS: 234281返回目錄GFPuv vectors Locatio

18、n of features 2 GFPuv gene Start codon (ATG): 289291; Stop codon: 10031005 GFP chromophore: 481489 wt GFP cDNA sequences (3): 289454 Synthetic GFP gene with cycle 3 mutations from pBAD-GFPuv (1): 4551007 Cycle 3 mutation F99S (TC): 584 Cycle 3 mutation M153T (TC): 7Cycle 3 Cycle 3 mutation V163A (TC

19、): 776 Cycle 3 silent mutation in L137 (TC): 699 Cycle 3 silent mutation in T225 (AT): 963 Q80R mutation (AG) (4): 527返回目錄GFPuv vectors Location of features 3 GFPuv gene Arg codons optimized for E. coli: R73 (AgACgT): 505507, R96(AgACgC): 574576, R12(AgACgT): 652654, R168 (AgACgC): 790792, R1215 (Ag

20、ACgT): 931933 Silent mutations (CccATccG) creating BspE I site: 510 & 513 Silent mutation (AG) creating Mlu I site: 612 Silent mutations (TtGgaACtCgaG) creating Xho I site: 709, 711 & 714 Silent mutations (AGTC) creating BamH I site: 811812 Silent mutation (CG) creating Sal I site: 894 Silent mutations (ActAGctC) creating Sac I site: 993 & 996 Silent mutation in S72 (AC): 504 返回目錄GFPuv vectors Location of features 4 3 MCS: 1071091 Ampicilin resistance gene Promoter: 35