基因工程基因工程的載體

1、基因工程基因工程的載體2022-5-7發(fā)展概況發(fā)展概況 1.1.第一階段（第一階段（19771977年前）：年前）：天然質粒和重組質粒的利用，天然質粒和重組質粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.第二階段：第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUCpUC系列載體。系列載體。 3.3

2、.第三階段：第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列載體，含系列載體，含T3T3，T7T7，sp6sp6啟動子載體，表啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。達型載體及各種探針型載體。 第1頁/共66頁2022-5-7第三章第三章 基因工程的載體基因工程的載體 作為基因工程載體的基本功能基本功能1. 運送外源基因高效轉入受體細胞2. 為外源基因提供復制能力或整合能力3. 為外源基因的擴增或表達提供條件第2頁/共66頁2022-5-7第三章第三章 基因工程的載體基因工程的載體 作為基因工程載體必須具

3、備的基本條件基本條件1. 具有對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）2. 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3. 長度盡可能小，以提高其載裝能力4. 具有多種單一的酶切位點5. 具有合適的選擇性標記第3頁/共66頁2022-5-7遺傳標記基因遺傳標記基因 1. 1. 標記基因的作用標記基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（載體或重組分子）分子（載體或重組分子）是否進入宿主是否進入宿主細胞細胞 這種指示可以是選擇性的（這種指示可以是選擇性的（ApApr r ，TcTcr r ，KanKanr r），也可以），也可以是非選擇性的（如是非選擇性的（如lacZlacZ） 2

4、 2）指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入載體分子是否插入載體分子形成了重組子。形成了重組子。 * * 這種指示也可以是這種指示也可以是選擇性選擇性的（如的（如TcTcS S），也可以是），也可以是非選非選擇性擇性的（如的（如TcTcS S， lacZ, GUSlacZ, GUS），絕大多數為后者。），絕大多數為后者。 * * *有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的多采用非選擇性的檢測性標記基因。有的基因是不

5、能用作檢測性標記基因。有的基因是不能用作選擇性標記基因（選擇性標記基因（lacZlacZ，GUSGUS等）。等）。第4頁/共66頁2022-5-72.2.標記基因的種類標記基因的種類 1 1）抗性標記基因抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）（可直接用于選擇轉化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金屬抗性基因重金屬抗性基因: Cu: Cur r ，ZnZnr r ，Cd Cd r r c. c. 代謝抗性基因代謝抗性基因: TK:

6、 TK，抗除草劑基因，抗除草劑基因 2 2）營養(yǎng)標記基因營養(yǎng)標記基因（可直接用于選擇轉化子）（可直接用于選擇轉化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，類的基因， 這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3 3）生化標記基因生化標記基因 其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ, GUS, lacZ, GUS, CATCAT 4 4） 噬菌斑噬菌斑 第5頁/共66頁2022

7、-5-73.3.使用標記基因注意要點使用標記基因注意要點 1 1）標記基因與宿主細胞）標記基因與宿主細胞 2 2）標記基因產物的作用機制）標記基因產物的作用機制: Ap: Apr r 3 3）標記基因的結構與適用范圍）標記基因的結構與適用范圍: : 基因啟動子基因啟動子, , 翻譯起翻譯起始序列始序列, , 密碼子偏愛性密碼子偏愛性 4 4）標記基因的結構變化對功能的影響）標記基因的結構變化對功能的影響: LacZ, GUS: LacZ, GUS 4.4.常用的遺傳標記基因常用的遺傳標記基因 1) 1) 四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因（TcTcr r） Tetracycline Tetracyc

8、line 可結合在核糖體可結合在核糖體30s30s亞基中的一種亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環(huán)素抗性基因蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種編碼一種399 AAs399 AAs蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環(huán)蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。素分子進入細菌細胞。第6頁/共66頁2022-5-72) 2) 氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性?？梢种萍毦毎ど蠀⑴c細胞壁合成酶類的活性。ApApr r抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周

9、間質的酶，催化抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，催化內酰胺內酰胺環(huán)的環(huán)的水解水解，使氨芐青霉素失活。，使氨芐青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） ChlorophenicolChlorophenicol可結合在核糖體可結合在核糖體50 S50 S亞基上，阻止蛋白質合亞基上，阻止蛋白質合成。成。CmCmr r基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素乙?；阴；?，導致乙?；瑢е乱阴；穆让顾夭荒芙Y合在核糖體上。的氯霉素不能結合在核糖體上。4) 4) 卡那霉素卡那霉素(Kan(Kanr r), ), 新霉素新霉素(Neo(Neo

10、r r) )和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r) )基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。來自轉座子類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。來自轉座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使這類抗生素抗性基因均可使這類抗生素磷酸化磷酸化，使之不能進入細胞，使之不能進入細胞內。內。第7頁/共66頁2022-5-75 5）半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZl

11、acZ） 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因產物不具酶活，基因產物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分：性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分：鏈和鏈和鏈。前者負責四聚體裝配，后者具鏈。前者負責四聚體裝配，后者具半乳糖苷酶活性；只有半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現出酶活性，該作用稱之為當兩者都存在時，才會表現出酶活性，該作用稱之為-互補作互補作用用。這兩個部分可獨立存在，。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。為分別由兩個基因編碼。為鏈編鏈編碼的基因稱之為碼的基因稱之為lacZlacZ( (編碼編碼145 AA

12、s)145 AAs)。這兩個基因（。這兩個基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作為標記基因。）均可作為標記基因。 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點半乳糖苷酶基因的優(yōu)點: : a.a.酶催化酶催化X-GalX-Gal水解為蘭色產物，檢測直觀水解為蘭色產物，檢測直觀 b. lacZb. lacZ編碼編碼5-5-端可容許很大的變化而不影響酶活性端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZc. lacZ和和鏈基因的分別表達可使載體小而容量大鏈基因的分別表達可使載體小而容量大第8頁/共66頁2022-5-76 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS） 該基因編碼一種可分解各種該基因編碼

13、一種可分解各種-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標記基因除具有上述解酶。該標記基因除具有上述lacZlacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。 7 7）熒光素酶基因熒光素酶基因 熒光素酶或由螢火蟲產生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產熒光素酶或由螢火蟲產生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產生熒光，若在反應中加入生熒光，若在反應中加入CoACoA，可使靈敏度提高，可使靈敏度提高1010倍；或由發(fā)光細倍；或由發(fā)光細菌（菌（Photobacterium fischeriPhotoba

14、cterium fischeri）產生的熒光素酶，它與）產生的熒光素酶，它與FMN-FMN-氧化氧化還原酶聯(lián)用，通過還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)HNAD(P)H的變化測定酶活的變化測定酶活。 8 8）發(fā)光蛋白質基因發(fā)光蛋白質基因 發(fā)光蛋白是由水母產生的一種可發(fā)光的蛋白質，該蛋白質可使發(fā)光蛋白是由水母產生的一種可發(fā)光的蛋白質，該蛋白質可使大腸桿菌菌落呈藍色。大腸桿菌菌落呈藍色。第9頁/共66頁2022-5-7 分子克隆載體的復制起點與種類分子克隆載體的復制起點與種類1. 1. 復制起點的種類復制起點的種類 1) 1) 核內復制起點核內復制起點 a. a. 染色體復制起點染色體復制起點原核生物原核

15、生物( (環(huán)狀環(huán)狀) )和真核生物和真核生物( (線狀線狀) )染色體染色體 b. b. 染色體外復制起點染色體外復制起點 i. i. 質粒質粒DNA,RNA,DNA,RNA,線狀線狀, ,環(huán)狀環(huán)狀, ,單鏈單鏈, ,雙鏈雙鏈 ii. ii. 病毒病毒同上同上, , 細胞內和病毒顆粒內細胞內和病毒顆粒內 2) 2) 核外復制起點核外復制起點 a. a. 線粒體線粒體所有真核細胞所有真核細胞 b. b. 葉綠體葉綠體所有綠色植物細胞所有綠色植物細胞 原核與真核生物原核與真核生物兩種質體中亦可能含有質粒兩種質體中亦可能含有質粒第10頁/共66頁2022-5-73. 3. 按復制起點劃分克隆載體按復

16、制起點劃分克隆載體 1) 1) 質粒復制型質粒復制型復制起點來自質?；蚓€粒體和葉綠體復制起點來自質?；蚓€粒體和葉綠體 2) 2) ARSARS復制型復制型ARSARS（autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence)，或，或稱染色體復制型稱染色體復制型3) 3) 病毒復制型病毒復制型復制起點來自病毒，若為復制起點來自病毒，若為RNARNA病毒，必須反轉病毒，必須反轉錄為錄為cDNAcDNA。 4) 4) 混合復制型混合復制型 a.a. 同種生物復制起點混合同種生物復制起點混合質粒形式存在；質?；虿《举|粒形式存在；質?；?/p>

17、病毒形式存在形式存在第11頁/共66頁2022-5-7例：大腸桿菌（例：大腸桿菌（E.coliE.coli）的）的噬粒噬粒（phagemidphagemid）載體既含有來自質粒）載體既含有來自質粒的復制起點，又含有來自噬菌體（如的復制起點，又含有來自噬菌體（如M13M13）的復制起點。在不）的復制起點。在不同條件下，它可以質?；蚴删w的復制起點進行復制，從而同條件下，它可以質?；蚴删w的復制起點進行復制，從而獲得質粒獲得質粒ds- DNAds- DNA或噬菌體或噬菌體ss ss DNADNA又如：釀酒酵母（又如：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyce

18、s cerevisiae）的某些載體既含有）的某些載體既含有質粒（質粒（22）復制起點，又含有）復制起點，又含有ARSARS片段片段 b.b. 不同生物復制起點混合不同生物復制起點混合穿梭載體穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）兩種兩種生物中均以質粒形式存在；在一種生物中以質粒形式存在，在另一種生物中均以質粒形式存在；在一種生物中以質粒形式存在，在另一種生物中以質?；虿《拘问酱嬖谏镏幸再|粒或病毒形式存在 * * 穿梭載體范圍穿梭載體范圍：細菌：細菌細菌（放線菌），細菌細菌（放線菌），細菌酵母菌，酵母菌， 細菌細菌真菌，細菌真菌，細菌動物動物第12頁/共66頁2

19、022-5-7分子克隆載體的復制起點種類、標記基因與拷貝分子克隆載體的復制起點種類、標記基因與拷貝數的關系數的關系 1. 1. 復制起點種類與拷貝數間的關系復制起點種類與拷貝數間的關系1) 1) 質粒復制起點類型：低拷貝（嚴緊型，質粒復制起點類型：低拷貝（嚴緊型，1-2 copies1-2 copies，受宿主染色，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型，體基因控制）；高拷貝（松弛型，20 copies20 copies，受宿主染色體控，受宿主染色體控制較弱）制較弱） 2) ARS2) ARS型載體：拷貝數較高（約型載體：拷貝數較高（約20 copies20 copies）3) 3) 病毒型復

20、制起點：高拷貝病毒型復制起點：高拷貝 2.2.標記基因與拷貝數的關系標記基因與拷貝數的關系 若標記基因表達效率高，宿主細胞可能不大量產生標記基若標記基因表達效率高，宿主細胞可能不大量產生標記基因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數會降低。對于不同標記因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數會降低。對于不同標記基因，可采取相應方法提高其拷貝數?；?，可采取相應方法提高其拷貝數。 如：對于藥物抗性標記基因，可提高藥物濃度。如：對于藥物抗性標記基因，可提高藥物濃度。 對于營養(yǎng)標記基因，可降低該基因的表達效率或更換其他低對于營養(yǎng)標記基因，可降低該基因的表達效率或更換其他低效率的標記基因效率的標記基因第13頁

21、/共66頁2022-5-7分子克隆載體的轉化頻率和穩(wěn)定性分子克隆載體的轉化頻率和穩(wěn)定性 1. 1. 影響轉化頻率的因素影響轉化頻率的因素 1) 1) 復制起點類型：盡可能選擇高拷貝復制起點復制起點類型：盡可能選擇高拷貝復制起點 2) 2) 標記基因：盡可能選擇高效表達的標記基因標記基因：盡可能選擇高效表達的標記基因 2.2.影響穩(wěn)定性的因素影響穩(wěn)定性的因素 1)1)復制起點類型復制起點類型低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差差 2)2)選擇壓力選擇壓力 3)3)載體在宿主細胞中的狀態(tài)載體在宿主細胞中的狀態(tài)自主復制型和整合型自主復制型和整合型 宿主細胞的遺傳特性和生

22、理特性宿主細胞的遺傳特性和生理特性第14頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coliE.coli 質粒載體質粒載體一、質粒（plasmid）的一般性質1、定義 質粒是存在于細菌細胞質中獨立于染色體而自主復制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）第15頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coliE.coli 質粒載體質粒載體一、質粒（plasmid）的一般性質2、特征 自主復制性自主復制性 質粒DNA攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori）以及一個控制質?？截悢档幕?，因此它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自

23、主復制 第16頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coliE.coli 質粒載體質粒載體一、質粒（plasmid）的一般性質2、特征 不相容性不相容性 利用同一復制系統(tǒng)的不同質粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被導入同一細胞中，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭 ，幾種質粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細胞中，這就是所謂的質粒不相容性。 第17頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coliE.coli 質粒載體質粒載體一、質粒（plasmid）的一般性質2、特征 可擴增性可擴增性 pMB1或ColEI類質粒在蛋白質合成中斷時，質粒復制能持續(xù)合成，這樣當用氯

24、霉素抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制時，帶有pMB1或ColEI復制子的質粒將利用豐富的原料大量復制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增氯霉素擴增。 第18頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coliE.coli 質粒載體質粒載體一、質粒（plasmid）的一般性質2、特征 攜帶遺傳標記攜帶遺傳標記 在實驗室中將質粒通過物理方法導入受體細胞，但是即使在最佳條件下，受體細胞中也只有少數細胞能穩(wěn)定地接受質粒，要想找到這些進入了質粒的受體細胞，就要利用載體質粒上的遺傳標記，天然質粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標記。 第19頁/共66頁2022-5

25、-7第一節(jié) E.coli 質粒載體一、質粒（plasmid）的一般性質3、分類 接合型和非接合型 嚴緊性和松弛型在基因工程中使用的質粒都是松弛型質粒第20頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coliE.coli 質粒載體質粒載體二、質粒（plasmid）載體的構建1、理想質粒載體所具備的條件 質粒較小 質粒帶有可供選擇的標記 帶有盡可能多的單一限制酶切位點 應有較高的基因表達能力第21頁/共66頁2022-5-7第一節(jié)第一節(jié) E.coli E.coli 質粒載體質粒載體二、質粒（plasmid）載體的構建2、質粒人工構建的目的 天然質粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工

26、程的載體必須對之進行改造構建：（1）加入合適的選擇標記基因加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇 （2）增加或減少合適的酶切位點增加或減少合適的酶切位點，便于重組 （3）縮短長度縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量增加裝載量 （4）改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （5）根據基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件加裝特殊的基因元件方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。第22頁/共66頁2022-5-71.多拷貝質粒 經過人工突變，除去控制拷貝數負調節(jié)基因，使質?？截悢颠_到每個細胞數千，用于擴增外源基因。 2. 測序質粒 拷

27、貝數高，加裝測定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆 3. 整合質粒 裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上 4.穿梭質粒 含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制 5.表達質粒 裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內的高效表達 6.探針質粒 篩選克隆或尋找基因元件，他通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動基因、終止子等。 人工構建的質粒根據其功能及用途分為：第23頁/共66頁2022-5-7第一節(jié) E.coli 質粒載體二、質粒（plasmid）載體的構建3、人工組建克

28、隆載體-pBR322 大?。?.3 kb 選擇標記：Apr Tcr 單一酶切位點：EcoR Hind BamH PstI Sal 等第24頁/共66頁2022-5-7第一節(jié) E.coli 質粒載體二、質粒（plasmid）載體的構建3、人工組建克隆載體-pBR322 用于組建pBR322的三個親本質粒的特征： pSE2124：Apr基因 pMB8 :Col EI松弛型復制子 pSC101:Tcr基因第25頁/共66頁2022-5-7第26頁/共66頁2022-5-7第一節(jié) E.coli 質粒載體二、質粒（plasmid）載體的構建4、人工組建克隆載體-pUC系列質粒 多拷貝大腸桿菌型質粒，包括

29、pUC8/9 pUC18/19 pUC的親本質粒是pBR322,包括如下四個部分： 來自 pBR322 的復制起點（ori） 來自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變） E.coli的lacZ基因及其啟動子組成lacZ 基因 lacZ內部人工組裝了一個多克隆位點（MCS）它含有如下單一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。第27頁/共66頁2022-5-7第一節(jié) E.coli 質粒載體二、質粒（plasmid）載體的構建4、人工組建克隆載體-pUC系列質粒 pUC系列質粒的優(yōu)點 更小的相對分子量和更高的拷貝數

30、可用組織化學法檢測重組體 具有多克隆位點（MCS）區(qū)段是基因工程中目前最常用的E.coli克隆載體第28頁/共66頁2022-5-7第一節(jié) E.coli 質粒載體三、質粒（plasmid）的制備1. 堿裂解法 （1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中 （2）加溶菌酶裂解細菌細胞壁 （3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內含物 （4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質 （5）離心取上清液，用苯酚氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質及核酸酶 （6）乙醇或異丙醇沉淀水相質粒 （7）無DNase的RNase處理殘余RNA第29頁/共66頁2022-5-7第一節(jié) E.co

31、li 質粒載體三、質粒（plasmid）的制備2.沸水浴法 （1）將菌體懸浮在含有EDTA和Triton X-100的緩沖液中 （2）加溶菌酶破細胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒 （4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 （5）乙醇異丙醇沉淀第30頁/共66頁2022-5-7一、一、Ti質粒載體質粒載體1.根癌農桿菌根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)與與Ti質粒質粒 G-菌，可侵入菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crowngalltumor)。冠癭瘤細胞具有以下特征：冠癭瘤細胞具有以下特征：i.不需要補充植物激素便可進行離體

32、培養(yǎng)不需要補充植物激素便可進行離體培養(yǎng) ii.ii.合成腫瘤特有的化合物合成腫瘤特有的化合物冠癭堿冠癭堿(opine)(opine)，能專一，能專一 的為根癌農桿菌所利的為根癌農桿菌所利用用. . 這兩個特征由這兩個特征由TiTi質粒決定，但該質粒中僅有一部分進入植物細胞。質粒決定，但該質粒中僅有一部分進入植物細胞。 三、其他質粒載體第31頁/共66頁2022-5-7二、二、釀酒酵母釀酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆載體的分子克隆載體1.克隆載體的種類克隆載體的種類1)按復制方式劃分按復制方式劃分i.自主復制型；自主復制型；ii.整合型（非自主復制型）整合型

33、（非自主復制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按復制子來源劃分按復制子來源劃分 i.附加體型附加體型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其復制起點來自于釀，其復制起點來自于釀酒酵母的天然質粒酒酵母的天然質粒-2質粒質粒ii.染色體復制型染色體復制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其復制起點來，其復制起點來自染色體上的自主復制序列自染色體上的自主復制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他質粒載體第32頁/共66頁2022-5-74.pYAC載體載體 酵母菌人工染色體酵母菌人工染

34、色體(yeastartificialchromosome,YAC)廣泛用于構建高等廣泛用于構建高等動植物基因組文庫的構建動植物基因組文庫的構建,由由YLp經適當改造后構建成經適當改造后構建成pYAC載體。載體。pYAC載體具有以下特點：載體具有以下特點： 1）雙雙TEL位點；位點；2）三個酵母菌遺傳標記基因；三個酵母菌遺傳標記基因；3）一個一個SUP4基因用于檢測重組子基因用于檢測重組子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑的赭色抑制突變基因，但把該基因轉入酵母菌的制突變基因，但把該基因轉入酵母菌的ade2赭色突變體時，宿主菌為白色赭色突變體時，宿主菌為白色菌落，要是在菌落

35、，要是在SUP4基因中插入外源基因中插入外源DNA片段后在轉化片段后在轉化ade2宿主菌，轉化子宿主菌，轉化子成紅色菌落。成紅色菌落。第33頁/共66頁2022-5-7YAC:酵母人工染色體（yeast artificial chromosome）目前能容納最大外源DNA片斷的載體. YAC載體有兩個臂，每個臂的末端有一個端粒（TEL），臂上有著絲粒（CEN）、自主復制序列（ARS）、選擇標記（TRP1和URA3）裝載容量：50Kb-2000KbYAC載體是以質粒的形式出現，如：pYAC2第34頁/共66頁2022-5-7第35頁/共66頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體一、l噬菌體的分子生

36、物學l噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和l DNA組成1. l-DNA的物理圖譜 l-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)，全長48.5kb。 左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞，DNA自主復制以及調控基因，中間是負責與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因第36頁/共66頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構建天然的lDNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實驗的載體1. 1. 縮短長度縮短長度 野生型lDNA包裝的上限為50.9kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多

37、為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實lDNA上約有40-50%的DNA片段（J-N區(qū)間）是復制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。第37頁/共66頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構建1.1.縮短長度縮短長度 插入型載體插入型載體 該類載體經改造后的長度為37kb，有單一酶切位點，便于外源DNA的插入。其允許插入片段最大為13.9kb。根據插入失活效應的特異性分為兩種亞型：免疫功能失活插入型載體半乳糖苷酶失活插入型載體第38頁/共66頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構建1.1.縮短長度縮短長度 替換型載

38、體（取代型載體）替換型載體（取代型載體） 該類載體經改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內含有兩個相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時用酶切開，分離去除這個14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 第39頁/共66頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構建2.2.刪除重復的酶切口刪除重復的酶切口插入型載體在插入位點有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點有兩個酶切口，多了也不行天然的l-DNA上有許多重復的酶切口，如：EcoRI 5個，HindIII 7個，這些多余的酶切口必須被刪除。第40頁/共6

39、6頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構建3. 構建琥珀型密碼子突變體 終止密碼子有三種：UAA（赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀） 琥珀型突變：CAG-UAG（stop） 將野生型-DNA上A和B兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG，當這種l-DNA進入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的A和B頭部蛋白，也就不能被包裝，不能裂解細菌。阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。第41頁/共66頁2022-5-7第二節(jié) 噬菌體載體三、l l-DNA作為載體的優(yōu)點1.l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染

40、大腸桿菌2.l-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量3.重組l-DNA的篩選較為方便4.4. 重組l-DNA分子的提取比質粒容易第42頁/共66頁2022-5-7第三節(jié) Cosmid載體一、Cosmid的定義 Cosmid（cos sitecarrying plasmid）：是一類由人工構建的含有l(wèi) l-DNA兩端cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。質粒復制子包括：一個復制起點和兩個抗性基因Apr 、Tcr。第43頁/共66頁2022-5-7Cosmid載體的特點載體的特點1.具有具有噬菌體的特性；噬菌體的特性；2.具有質粒載體的特性；具有質粒載體的特

41、性；3.具有較高容量的克隆能力；具有較高容量的克隆能力；4.具有與同源性序列的質粒進行重組的能力具有與同源性序列的質粒進行重組的能力第44頁/共66頁2022-5-7第三節(jié) Cosmid載體二、Cosmid的構建 Cosmid含有l(wèi)-DNA兩端cos區(qū)的質粒。由于l-DNA包裝時，其包裝蛋白只識別粘性末端附近的一小段順序，均1.5kb長。如果將這一小段DNA與質粒連在一起，則這個重組質粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時它仍可象l-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與噬菌體DNA所不同的是，Cosmid不能在體內被包裝，更不能裂解細胞，它的制備與質粒相同。進

42、入細胞后，通過質粒上的復制子進行復制。第45頁/共66頁2022-5-7第三節(jié) Cosmid載體三、Cosmid的優(yōu)越性1. 能象l-DNA一樣體外包裝，并高效導入受體細胞2. 可以裝載比質?；騦-DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7 kb，質粒長為3.3kb，則該Cosmid最大可裝載45.9kb的外源DNA3. 由于攜帶質粒的選擇標記，便于篩選4. 由于質粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。第46頁/共66頁2022-5-7采用Cosmid作載體的困難載體自身只相當于可以插入片段的載體自身只相當于可以插入片段的1/101/10左右，因此往往會出現載體同左右，因此往往會

43、出現載體同載體自身連接，結果在一個重組分子內可有幾個柯斯質粒載體連在一起。載體自身連接，結果在一個重組分子內可有幾個柯斯質粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結果使在基因大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結果使在基因組內本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結果的分組內本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結果的分析，后來專門選出析，后來專門選出303045kb45kb的外源的外源DNADNA插入載體插入載體DNADNA，此時，每個載體只，此

44、時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；粒的限度；細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質粒制備基因文庫，則細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一篩選所需的含某一DNADNA片段的菌落很費時間。片段的菌落很費時間。第47頁/共66頁2022-5-7第四節(jié) 單鏈DNA噬菌體M13一、M13單鏈噬菌體的分子生物學 M13是一種單鏈DNA噬菌體，總長6407bp，閉合環(huán)狀正鏈ssDNA。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內孔將DNA注入細菌

45、體內。 單鏈DNA利用宿主細胞的復制另一條鏈（負鏈），形成dsDNA（RFDNA），故M13能以dsDNA的形式從細胞中分離作為克隆載體宿主細胞不會發(fā)生裂解。第48頁/共66頁2022-5-7M13載體 具有多克隆位點(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點與質粒載體pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時分離分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。根據M13的生物學特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子

46、代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源克隆時的取向。這樣一來，為分別分離外源分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個行之有效的方法就是定向克隆技術。 第49頁/共66頁2022-5-7第四節(jié) 單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點及用途1、最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，單鏈DNA的用途： 用于雙脫氧末端終止測定DNA順序用于單鏈DNA的定點誘變 用于合成探針第50頁/共66頁2022-5-7第四節(jié) 單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點及用途2. 篩選方便 感染的受體細胞生長緩慢，形成渾濁圈，易于挑選辨認而且重組分

47、子越大，渾濁圈的渾濁度亦越大，這樣可以直接辨認哪些菌落含有外源DNA片段。第51頁/共66頁2022-5-7第五節(jié) 其他載體一、BAC：細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome） 基于F因子建立起來的單拷貝E.coli載體，裝載容量300Kb，穩(wěn)定性較好，用于克隆大片端DNA，從而構建整個人類基因組文庫第52頁/共66頁2022-5-7BAC載體第53頁/共66頁2022-5-7 質粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構建時一般都把細菌質

48、粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40）、逆轉錄病毒和昆蟲桿狀病毒等。動物分子克隆載體第54頁/共66頁2022-5-7（二）（二）病毒型載體病毒型載體1.特點特點 1)可在動物細胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構成組分來自天然病毒可在動物細胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構成組分來自天然病毒或原病毒細胞）或原病毒細胞）2)DNA轉移效率高，但必須與天然轉移效率高，但必須與天然(輔助輔助)病毒共感染動物細胞病毒共感染動物細胞3)大多數被感染動物細胞將是致死的，但有少數病毒（如逆病大

49、多數被感染動物細胞將是致死的，但有少數病毒（如逆病毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體DNA中。中。4)插入病毒載體的外源基因只能在動物細胞中作瞬時表達插入病毒載體的外源基因只能在動物細胞中作瞬時表達2.載體種類載體種類根據構建載體的病毒基因大小可分為兩類：根據構建載體的病毒基因大小可分為兩類：第55頁/共66頁2022-5-71）復制型：由小分子病毒DNA構建而成，具復制起點，其克隆位點可在病毒DNA之內，亦可在病毒DNA之外，這類載體有的容量十分有限（如SV40），有的則很大（如HSV），其容量大小主要取決于病毒外殼蛋白的包裝能力。2）非復制型：這類載體是在細菌克隆載體中插

50、入一段病毒DNA（不含復制起點）。當外源DNA插入該載體后，與相應的天然病毒一起感染動物細胞，外源DNA可借助兩病毒DNA同源部分的重組插入天然病毒。這類載體特別適合于那些較大的病毒DNA分子。實例：痘病毒長180kb,編碼150多種多肽，整個生存階段均在細胞質內，它能合成DNA復制、轉錄和轉錄后修飾的各種酶類，由此病毒構建的非復制型載體就是在細菌載體中插入一段痘病毒DNA.第56頁/共66頁2022-5-7（三）質粒型載體 1.特點：不能形成病毒顆粒，以高拷貝質粒形式存在于動物細胞內，不導致動物細胞死亡。2.組成：pMB1和病毒復制起點（如SV40，BPV，EBV等），適合于細菌和動物細胞的

51、選擇標記基因。 3.實例1)SV40質粒載體SV40具如下物理圖譜，5243bp,為兩種抗原（T-和t-抗原）和三種病毒衣殼蛋白編碼。其中T-抗原參與SV40的有效感染，并能特異地結合在病毒DNA復制起點上，這種結合對DNA復制是必須的。因復制起點與該基因的啟動子順序相近，故它本身的表達也受到T-抗原的控制。當含SV40復制起點的質粒型載體或重組DNA分子轉入COS細胞后(含有SV40的T-抗原)可大量復制,其拷貝數可達20-40萬。第57頁/共66頁2022-5-7發(fā)展概況發(fā)展概況 1.1.第一階段（第一階段（19771977年前）：年前）：天然質粒和重組質粒的利用，天然質粒和重組質粒的利用

52、，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.第二階段：第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUCpUC系列載體。系列載體。 3.3.第三階段：第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列載體，含系列載體，含T3T3，T7T7，sp6sp6啟動子載體，表啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。達型載體及各種探針型載體。 第58頁/共66頁2022-5-72) 2) 氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性?？梢种萍毦毎ど蠀⑴c細胞壁合成酶類的活性。ApApr r抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，催化抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，催化內酰胺內酰胺環(huán)的環(huán)的水解水解，使氨芐青霉素失活。，使氨芐青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） Chloro