實驗七植物組織RNA的提取

1、實驗七、 植物組織RNA的提取二零一二.九1植物RNA植物細胞內(nèi)的RNA主要是 rRNA（占8085）、tRNA及小分子RNA（占1015）和 mRNA（占15）。 Northern雜交，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及RFLP等分子生物學(xué)研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關(guān)鍵一步。2真核生物mRNA結(jié)構(gòu)mRNA的帽子結(jié)構(gòu)由一系列酶促反應(yīng)生成poly(A)尾巴的形成帽子結(jié)構(gòu)3RNA提取Trizol ：苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，異硫氰酸胍：可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與

2、蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇或乙醇沉淀RNA硅膠膜特異性吸附的離心柱提取法4RNase酶非常穩(wěn)定，耐高溫，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活，RNase廣泛存在于人的皮膚上。RNA提取的關(guān)鍵是控制RNase的污染，而手是污染的主要來源之一DEPC（diethypyrocarb

3、onate，焦碳酸二乙酯）和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性，用1 DEPC處理可以使RNase失活（但DEPC會與Tris和DTT發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失效），所以所有的器具均需用DEPC處理過的水沖洗。玻璃器具用180烘烤4h以上處理。DEPC本身是劇毒致癌物，DEPC水需高壓滅菌使DEPC失活。 RNase酶5RNA反轉(zhuǎn)錄RT-PCR 即反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cD

4、NA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。6反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscripatase）：以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補的DNA（cDNA）鼠白血病病毒（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為427引物的選擇Oligo dT 選擇Oligo dT時，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的

5、穩(wěn)定性要好。 隨機引物 適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況。第一鏈cDNA合成反應(yīng)以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5g總RNA的隨機引物的用量為50ng。特異性引物 特異性引物只能設(shè)計引物時的下游引物做RT，引物設(shè)計質(zhì)量影響RT的結(jié)果，但要注意不同引物退火溫度的不同。8Trizol法提取葉片總RNA煙草或擬南芥葉片0.05-0.1 mg加液氮在研缽中研磨成粉末，轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中加1mL Trizol reagent，室溫放置5 10min。12,000 rpm離心5 min,棄沉淀。

6、每毫升Trizol reagent中加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 sec，室溫放置15min4 12,000 rpm離心10 min，取上清轉(zhuǎn)到新的離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（或0.6倍體積異丙醇），室溫放置 30 min4 12,000 rpm離心10 min，棄上清，用1ml 75%乙醇洗沉淀兩次，4 12,000 rpm離心5 min，棄上清，敞蓋晾干加50 L DEPC處理過的ddH2O溶解沉淀，-80 保存核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的解離禁用渦旋振蕩器不要吸中間界面75%乙醇用DEPC水配制9RNA濃度和純度檢測紫外分光光度計OD260時，ssRNA 1OD = 40 g/m

7、l核酸濃度（g/ml）=OD26040稀釋倍數(shù)OD260/OD280約為1.72.0 質(zhì)量較好 OD260/OD280 2.0說明RNA降解10RNA電泳VS變性電泳：甲醛變性電泳，用于Northern雜交等。DNA污染RNA降解11RT-PCR按次序在0.2 mL 無RNase的離心管中加入如下成份進行反轉(zhuǎn)錄：RT-PCR反應(yīng)液：RNA樣品（Total RNA） 50ng-5gOligo（dT) Primer 1 L2TS Reaction Mix 10 LgDNA Remover 1LTransScript TM RT/RI Enzyme Mix 1LRnase-Free H2O to 2

8、0 L42 30 min85 加熱5min 失活TransScript TM RT/RI 與gDNA Remover 。12注意事項成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中需加入RNase抑制劑以增加c DNA合成的長度和產(chǎn)量勤換手套，防止皮膚上的RNase污染Trizol、DEPC等有毒，與皮膚接觸會引起傷害，操作過程必須帶手套別用手碰任何與樣品接觸的物品。使用新的已滅活RNase的塑料器皿與用具（RNase-free槍頭和EP管）整個操作過程中最好在低溫（4）或是冰上進行提出的RNA應(yīng)保存于70，避免頻繁凍融電泳液使用新配制的電泳液，跑膠電壓高于正常電壓，縮短跑膠