Dukes A、B期大腸癌淋巴結微轉移的檢測及其對預后的影響：附全文PDF

DukesA、B期大腸癌淋巴結微轉移的檢測及其對預后的影響：附全文PDFSCI〔〕:

【作者】湯睿王兵唐思聰劉炳亞朱正綱

【關鍵詞】結腸直腸腫瘤腫瘤轉移預后病理學臨床

【出版日期】2022-09-25

【摘要】目的:討論DukesA、B期大腸癌淋巴結微轉移的檢測和淋巴結微轉移對預后的影響。方法:于前瞻性研究31例行根治性手術的DukesA、B期大腸癌病人,應用逆轉錄聚合酶鏈反響(RT-PCR)檢測所去除的398枚淋巴結中細胞角蛋白(cytokeratin,CK)20mRNA的表達以檢出微轉移;經(jīng)5年以上的隨訪,討論淋巴結微轉移對預后的影響和術后復發(fā)的可能原因。結果:在31例DukesA、B期大腸癌病人的398枚淋巴結中,有15例(48.39%)共46枚(11.56%)淋巴結檢出微轉移。單因素分析提示微轉移的淋巴結數(shù)量、位置及腫瘤生長方式與術后復發(fā)有關;Logistic多元回歸模型提示,3枚以上淋巴結發(fā)生微轉移與復發(fā)嚴密聯(lián)絡。

結論:CK20RT-PCR是檢測DukesA、B期大腸癌淋巴結微轉移靈敏而特異的方法。3枚以上淋巴結發(fā)現(xiàn)微轉移是預示復發(fā)的獨立因素。

【刊名】外科理論與理論

淋巴結轉移狀況是判斷大腸癌病人預后和指導術后化療的重要指標[1,2]。常規(guī)的病理組織學檢查在敏感性等許多方面存在缺乏,近年通過連續(xù)切片、免疫組化和逆轉錄聚合酶鏈反響(PT-RCR)等方法均可在局部蘇木精-伊紅(HE)染色陰性的淋巴結中檢出微小轉移【1】。筆者既往也曾應用RT-PCR法進展大腸癌淋巴結轉移的檢測,結果發(fā)現(xiàn)RT-PCR法檢出淋巴結轉移的敏感性高于HE染色,并能檢出HE陰性淋巴結中的微轉移灶【3】。DukesA、B期是指HE檢查未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移者,預后相對較好,但其中仍有10%～25%的病人在術后5年內出現(xiàn)復發(fā)【2】。因此本研究針對DukesA、B期病人,仍采用RT-PCR法檢測淋巴結微轉移,并討論淋巴結微轉移的發(fā)生對預后的影響。

材料與方法

一、病例資料和標本采集前瞻性研究。

所有病例均為1999年1～12月入我院普外科,實驗終止于2022年12月。入組條件:①行根治性手術的大腸癌病人,經(jīng)術后常規(guī)病理檢查分期為DukesA、B期;②術前無放、化療史。術后定期檢查隨訪,隨訪期均超過5年,排除失訪者和因其他病因導致死亡的病例。至實驗終止共搜集31例病人。術后總隨訪期為60～70個月,期間記錄病人的復發(fā)情況,死亡病人的生存期為手術至腫瘤轉移復發(fā)死亡的時間,存活病人的生存期為手術至研究終止的實際時間。31例大腸癌病人中男17例,女14例;年齡32～80歲,平均(60.213.7)歲。結腸癌18例,直腸癌13例;DukesA期5例,DukesB期26例;腫瘤超過腸腔周徑1/2者11例,未超過者20例;腫瘤呈膨脹型生長14例,浸潤型生長17例;病理檢查分化好5例,中等分化18例,分化差8例。手術切除的標本立即別離淋巴結并取一小塊腫瘤組織,每枚淋巴結縱行切開,一半做常規(guī)病理切片HE染色,另一半與腫瘤組織液氮凍存直至RNA抽提。淋巴結總數(shù)為398枚,平均每例病人(14.76.3)枚。此外,取2例良性胃腸道病變的15枚淋巴結(1例胃潰瘍病人10枚,1例直腸腺瘤病人5枚)作為陰性對照;取2例DukesC期大腸癌病人的8枚HE染色陽性淋巴結作為陽性對照。

二、RT-PCR檢測方法本

實驗采用RT-PCR法定性檢測淋巴結中細胞角蛋白(CK)20mRNA的表達,同時選擇管家基因GAPDH作為內參證明抽提RNA的完好性。Trizol試劑(華舜公司產(chǎn)品)抽提組織總RNA(詳細步驟詳見操作手冊),取局部RNA樣品稀釋后測光密度(OD)值,OD260/OD280為1.8～2.0,并換算濃度。采用AccessRT-PCR試劑盒(Promega),逆轉錄和PCR在同一試管、單一緩沖液中完成。每個RNA樣品分別用CK20和GAPDH引物進展RT-PCR反響。反響體系25l,含5x緩沖液5l(終濃度為1)x,dNTP0.5l(終濃度0.2mM),上游和下游引物各0.5l(終濃度1M),25mMMgSO41l(終濃度1mM),AMV逆轉錄酶、TflDNA合成酶各0.5l(終濃度0.1M/l)和1g總RNA。加樣完成后,細微振蕩混勻,放入PTC-100TM熱循環(huán)儀(MJResearch)。首先48℃、45min進展逆轉錄(cDNA第1鏈合成),然后94℃、2min使AMV酶失活并使RNA/cDNA/引物變性,以后按以下條件合成cDNA第2鏈和進展PCR擴增。CK20引物存在時反響條件為94℃1min、62℃2min、68℃2min共40次循環(huán);GAPDH引物存在時為94℃1min、63℃1min、68℃2min共30次循環(huán),最后68℃7min。引物序列如下:CK20,正義:5-prime;CAGACACACGGTGAACTATGG-3,prime;反義:5-prime;GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3;prime;GAPDH,正義:5-prime;ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3,prime;反義:5-prime;CGCCTGCTTCACCACCTTCT-3prime;。擴增終產(chǎn)物長度分別為370bp和626bp。同時用不加RNA的反響體系進展PCR擴增作為空白對照;不加AMV逆轉錄酶進展PCR擴增排除基因組DNA的污染。取10lRT-PCR產(chǎn)物在含0.5l/ml溴乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中進展電泳,電泳后的凝膠由Floruo-SMultiImage全自動圖像分析儀(BIORAD)掃描并打印成像。PCR產(chǎn)物應用ABIPTISMBigDyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReac-tionKitwithAmpliTaqDNAPolymerase,FS(PerkinElmer),采用ABIPTISMTM377XLDNA測序儀檢測序列。

三、統(tǒng)計方法

大腸癌病人發(fā)生淋巴結微轉移與各臨床病理因素的相關性分析采用Fish確切概率法。生存率的計算采用Kaplan-Meier法,Log-rank檢驗比擬不同組的生存率。各因素與復發(fā)的危險度單因素分析采用Mantel-Haenszel法,多因素分析采用Logistic回歸模型。所有統(tǒng)計計算由SAS軟件(v6.12)完成。

結果

一、樣本檢測結果

1.腫瘤、對照樣本:31例大腸癌病人的腫瘤組織和2例良性胃腸道疾病的病變組織(胃潰瘍和直腸腺瘤組織)RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳均可見370bp的條帶(圖1),即表示有CK20mRNA的表達;2例良性胃腸道病變的15枚淋巴結RT-PCR結果均為陰性(見圖2),而2例DukesC期病人的8枚HE染色陽性淋巴結RT-PCR結果均為陽性。以上標本GAPDH的RT-PCR產(chǎn)物均可見626bp的條帶,證實RNA完好無降解。不加RNA的反響體系作為空白對照進展PCR擴增結果為陰性;不加AMV逆轉外科理論與理論2022年第10卷第5期錄酶的反響體系進展PCR擴增結果為陰性,證實無基因組DNA的污染。將存在CK20引物的陽性PCR產(chǎn)物進展測序,結果與GeneBank檢索所獲得的序列一致,提示RT-PCR結果正確。

2.大腸癌病人的淋巴結樣本:31例DukesA、B期大腸癌病人的398枚淋巴結中,有15例共46枚淋巴結RT-PCR結果為陽性(見圖3),即存在微轉移,淋巴結數(shù)陽性率為11.6%,例數(shù)陽性率48.4%。其中5例DukesA期大腸癌病人的50枚淋巴結中有2例3枚淋巴結檢出微轉移;26例DukesB期大腸癌病人共348枚淋巴結中有13例43枚淋巴結檢出微轉移。所有病例中發(fā)現(xiàn)有3枚以上淋巴結微轉移者8例(25.8%),均為DukesB期;發(fā)現(xiàn)N2站以上淋巴結微轉移者9例(29.0%),也均為DukesB期。

二、大腸癌出現(xiàn)淋巴結微轉移與各臨床病理因素的關系

31例DukesA、B期大腸癌病人微轉移的發(fā)生與病人的年齡、性別、腫瘤進犯腸管周徑、生長方式、分化程度和Dukes分期等臨床病理因素均無顯著相關(見表1)。

三、隨訪結果及預后

至研究終止,共有8例病人出現(xiàn)轉移復發(fā)。其中5例為肝轉移,3例局部復發(fā),除2例術后發(fā)現(xiàn)肝左葉單發(fā)轉移灶再手術切除目前分別存活63和68個月外,其余均死亡,5年生存率為80.6%。JSurgConceptsPract2022,Vol.10,No.5*:P1/2周)0.7679生長方式(浸潤型/膨脹型)0.0184*分化程度(好、中/差)0.2554微轉移淋巴結數(shù)(ge;3/0～3)0.0059*Delta;發(fā)生微轉移淋巴結的位置(N2以上/N1或無)0.0155*生1.000.750.500.25存率0.00010203040506070術后時間(月)a.根據(jù)有無微轉移分組無微轉移組(n=16)微轉移組(n=15)P>0.05生存率1.000.750.500.250.000～2個陽性淋巴結組(n=23)3個以上陽性淋巴結組(n=8)P=0.0053010203040506070術后時間(月)b.根據(jù)微轉移淋巴結數(shù)量分組生存率1.000.750.500.250.00N0,N1(n=22)N2,N3(n=9)P=0.0124010203040506070術后時間(月)c.根據(jù)微轉移淋巴結位置分組圖4不同微轉移大腸癌病人的術后生存率表2DukesA、B期大腸癌復發(fā)原因的單因素分析臨床病理因素陽性(n=8)復發(fā)陰性(n=23)PRR95%CI年齡(歲)ge;62/1/2周3/58/151.00001.09090.3196～3.7240生長方式浸潤型/膨脹型7/110/130.0454*5.76470.8021～41.4311分化程度好、中/差7/116/70.64172.43480.3517～16.8534微轉移淋巴結數(shù)(n)ge;3/0～35/33/200.0135*4.79171.4667～15.6545發(fā)生微轉移淋巴結的位置N2以上/N1或無5/34/190.0272*4.07411.2233～13.6678*P1/2周7/86/120.4928生長方式浸潤型/膨脹型10/58/80.4725分化程度好、中/差12/311/50.6853Dukes分期A期/B期2/133/131.00001.淋巴結微轉移對生存的影響:微轉移組5年生存率為66.7%(10/15),無微轉移組為93.8%(15/16),兩組無顯著差異(圖4a)。3枚淋巴結微轉移組的5年生存率為50.0%(4/8),而少于3枚組為91.3%(21/23),兩組差異顯著(圖4b)。N2站及以上淋巴結微轉移組的5年生存率為55.6%(5/9),N1站及無轉移組為90.9%(20/22),兩組差異顯著(圖4c)。2.復發(fā)危險度分析:單因素分析提示,腫瘤呈浸潤型生長、>3枚淋巴結和N2站以上淋巴結有微轉移與復發(fā)關系顯著(表2)。Logistic回歸分析提示,>3枚淋巴結有微轉移是復發(fā)的獨立因素(表3)。表3DukesA、B期大腸癌復發(fā)原因多元Logistic回歸分析外科理論與理論2022年第10卷第5期

討論

一、大腸癌淋巴結微轉移的檢測方法

淋巴結轉移與否是判斷大腸癌預后和指導術后化療的重要指標。長期以來,臨床上采用病理切片HE染色判斷淋巴結的轉移情況,并將無遠處轉移、HE染色未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移者定義為DukesA、B期。但仍有10%～25%組織學證實淋巴結陰性的病人在術后5年內出現(xiàn)復發(fā)【2】,近年用連續(xù)切片、免疫組化和PT-RCR等多種方法對HE染色陰性淋巴結進展檢測,均發(fā)現(xiàn)其中的局部淋巴結存在微轉移【1】。因此,用HE染色法檢測淋巴結轉移的敏感性是不夠的。其他方法中,連續(xù)切片法工作量過大,臨床難以推廣。免疫組化法盡管有助于檢出淋巴結微轉移,但目前可供選擇的抗體其特異性和敏感性還不能滿足診斷的要求,作為一種形態(tài)學方法,還存在陽性判斷標準不一致的缺點,且切片的數(shù)量有限,缺乏以反映整個淋巴結的情況,能否作為預后指標也存在爭議[1,4～6]。RT-PCR法通過逆轉錄并擴增正常被檢組織不表達而腫瘤或腫瘤來源組織表達的mRNA以證實微轉移的存在,由于PCR強大的擴增效應,具有很高的敏感性,可以在105～107個正常細胞中檢出1個腫瘤細胞[1,3]。本實驗選擇的靶RNA是CK20mRNA,CK20是一種細胞骨架蛋白,在正常人體內的表達主要局限于胃腸道上皮,而在正常淋巴結的淋巴細胞和上皮細胞中不表達【7】,同時CK20在幾乎所有大腸癌組織中均表達[8],因此具有較高的特異性,是目前用于大腸癌微轉移檢測的最常用指標之一。本實驗中所有大腸癌病人的腫瘤組織和2例良性胃腸道疾病的病變組織均表達CK20mRNA,而2例良性胃腸道疾病的15枚陰性淋巴結均不表達,證實CK20RT-PCR具有較高的特異性。31例病人的398枚淋巴結中,有15例46枚淋巴結發(fā)現(xiàn)微轉移,說明該法能發(fā)現(xiàn)DukesA、B期大腸癌淋巴結的微轉移,淋巴結微轉移在DukesA、B期大腸癌病人中并不少見。

二、淋巴結微轉移檢測的臨床意義及其對預后的影響

在較早開展研究的乳腺癌[9]和黑色素瘤[10]研究報道中,認為淋巴結微轉移檢測對預后有影響,并已用于前哨淋巴結的檢測。而對于大腸癌,其意義仍存在爭議,有認為淋巴結即使存在微轉移也已被切除;也有認為由于敏感性過高,檢出的腫瘤細胞并不具有活性。對預后的影響有不同的報道結果,免疫組化方面報道多認為對預后無影響【1】,RT-PCR的一些報道那么認為其是影響術后復發(fā)和生存的重要因素[11,12]。其實這些結果都可從以下方面來理解和解釋:①淋巴道是大腸癌早期轉移的重要途徑,淋巴結存在轉移也間接提示其他部位存在微小轉移,只不過常規(guī)檢查未能發(fā)現(xiàn)而已,這也就是為什么大局部DukesC期病人雖進展了包括淋巴結清掃的根治術,但仍有不少病人術后復發(fā),且多數(shù)為肝轉移和局部復發(fā)而非淋巴結;此外,近年提出的"淋巴血管生成";理論也是重要佐證[13];②僅一局部微小轉移的腫瘤細胞最終能開展形成顯性轉移,其發(fā)生與轉移腫瘤細胞本身的基因型、表型、局部微環(huán)境以及是否能誘導腫瘤血管生成等諸多因素有關[13];③各實驗室采用的方法、操作步驟不統(tǒng)一,研究樣本較小。從本研究的結果來看,如將病例分為淋巴結微轉移組和無微轉移組,盡管前者的5年生存率低于后者,但統(tǒng)計學無差異。如按照淋巴結個數(shù)或分站進展比擬,有3枚淋巴結微轉移組病人的生存率顯著低于3枚以下組,N2及以上淋巴結微轉移組的生存率顯著低于N1及無轉移組,提示微轉移負荷量和到達位置可能較單純顯示微轉移存在對于推斷預后更有價值。對復發(fā)因素進展危險度分析,單因素分析發(fā)現(xiàn)浸潤型生長、3枚以上淋巴結和N2以上淋巴結發(fā)生微轉移與復發(fā)關系顯著;多元回歸分析,3枚以上淋巴結發(fā)生微轉移是復發(fā)的獨立預后因素。提示DukesA、B期病人如發(fā)現(xiàn)這些情況,那么是復發(fā)的高危病例,應該進展更積極的隨訪觀察和治療,比方對這些DukesA期病人也應進展化療,DukesB期病人應調整放、化療方案,隨訪檢查應更加細致等。

三、技術更新和前景

前文曾提到RT-PCR法的一些缺乏和局限【3】,近年來技術方法的改良使情況有所改善,如采用定量RT-PCR法[14]使實驗更加快捷、簡便,也有助于減少假陽性率;通過顯微切割技術[15]已可以抽提蠟塊組織的mRNA,使大規(guī)模的回憶性研究成為可能。雖然本研究是國內首例報道RT-PCR檢測DukesA、B期大腸癌淋巴結微轉移對預后影響的前瞻性研究,但仍然只是一個小樣本研究。對于是否可以將有淋巴結微轉移的DukesA、B期病人提JSurgConceptsPract2022,Vol.10,No.5升為C期,是否可將此作為指導放、化療的指征等問題,仍然需要統(tǒng)一標準操作的大樣本、多中心研究才能得出結論?？傊?CK20RT-PCR法是檢測DukesA、B期大腸癌淋巴結微轉移較為敏感而特異的方法,發(fā)現(xiàn)微轉移的淋巴結數(shù)量、位置和腫瘤生長方式與術后復發(fā)有關,3枚以上淋巴結發(fā)生微轉移是復發(fā)的獨立預后因素。DukesA、B期大腸癌淋巴結微轉移的檢測及其對預后的影響@湯睿$上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院普外科!上海200011@王兵$上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院普外科!上海200011@唐思聰$上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院普外科!上海200011@劉炳亞$上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院普外科上海消化外科研究所!上海200025@朱正綱$上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院普外科上海消化外科研究所!上海200025結腸直腸腫瘤;;腫瘤轉移;;預后;;病理學,臨床目的