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文檔簡(jiǎn)介

菌種保藏技術(shù)主講:傅文紅主要內(nèi)容:一、菌種保藏的目的二、菌種保藏的原理(掌握)三、菌種保藏的方法(重點(diǎn))什么是菌種衰退?生產(chǎn)菌株性狀的劣化或遺傳標(biāo)記的丟失:1、菌落形態(tài)的改變2、生長(zhǎng)速度緩慢3、生產(chǎn)能力下降4、抗不良環(huán)境能力減弱(抗噬菌體、低溫等)菌種退化的防止1、減少傳代次數(shù)2、用單核細(xì)胞和單菌落移種傳代3、菌種純化4、采用良好培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件5、科學(xué)的保藏一、菌種保藏的目的

菌種保藏的目的是:使菌種長(zhǎng)期保藏之后,仍然保持著原有的生命力、優(yōu)良生產(chǎn)性能、形態(tài)特征,以及不污染雜菌和不發(fā)生蟲害。二、菌種保藏的原理菌種保藏的原理是通過(guò)低溫、干燥、隔絕空氣(真空)和斷絕營(yíng)養(yǎng)、加保護(hù)劑等手段,以達(dá)到最大限度地降低菌種的代謝強(qiáng)度,抑制微生物的生長(zhǎng)與繁殖。由于菌種的代謝相對(duì)靜止,生命活動(dòng)將處休眠狀態(tài),所以能夠保藏較長(zhǎng)時(shí)間。三、菌種保藏的方法1、斜面低溫保藏

(定期移植法)2、液體石蠟保藏3、砂土管貯藏4、

麩皮保藏法5、懸液保藏

1)生理鹽水保藏法;2)蒸餾水保藏法:

6、冷凍真空干燥保藏法7、液氮超低溫保藏法8、甘油保藏法斜面低溫保藏(定期移植法)這是一種常用最簡(jiǎn)便的保藏方法。為了減少培養(yǎng)基水分散發(fā),延長(zhǎng)保藏時(shí)間,在配制時(shí)瓊脂用量加到2.5%,再加入0.2%磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及碳酸鈣等緩沖劑,以中和保藏過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸??梢杂脽o(wú)菌膠塞代替棉塞,既能防止污染,又可隔絕氧氣,避免斜面干燥細(xì)菌:1個(gè)月,酵母菌3個(gè)月,放線菌、霉菌半年。二)、液體石蠟法

操作簡(jiǎn)便,只要在菌苔上灌注一層無(wú)菌的液體石蠟,即可使菌種與外界空氣隔絕,達(dá)到防止培養(yǎng)基水分散失,抑制菌絲新陳代謝,推遲菌種老化,延長(zhǎng)菌種生命和保存時(shí)間的目的。此種方法也稱為隔絕空氣保藏法。

三)、砂土管貯藏:此法應(yīng)用廣泛,適于貯藏孢子和酵母狀分生孢子,而對(duì)菌絲體不適用。此法保藏孢子,壽命可達(dá)2~10年,使用時(shí)在無(wú)菌條件下,挑取少許砂土孢子,抖撒在PDA斜面上,適溫培養(yǎng),菌絲生長(zhǎng)后,再轉(zhuǎn)管培養(yǎng)1次。

1.準(zhǔn)備砂土:

細(xì)河砂,用內(nèi)徑0.250~0.177毫米篩孔過(guò)篩,除去粗粒和砂未;

紅黃壤土,內(nèi)徑0.149毫米過(guò)篩,用磁鐵襯紙吸除砂土中鐵屑,用0.05~0.1N鹽酸浸泡半天,除去有機(jī)質(zhì)。然后用清水反復(fù)沖洗至酸堿度近中性后,置于60~80℃烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合,分裝入10毫米×100毫米試管或安瓿瓶?jī)?nèi),每管裝量0.5克,經(jīng)0.11兆帕121℃高壓滅菌30分鐘,每天1次,共3次,或160℃干熱滅菌1次,保持2~3小時(shí)。滅菌后挑取少許砂土移至PDA斜面上培養(yǎng),證實(shí)無(wú)雜菌即可。2、接種:

干接:用接種環(huán)直接挑取孢子2~3環(huán),拌入砂土管中濕接:將孢子刮入5毫升無(wú)菌水的試管內(nèi),充分搖勻,制在孢子懸液,然后用1毫升吸管吸取懸液,每管中加入0.2毫升。3、貯藏:干接法制成的砂土管,直接放在盛有無(wú)水氯化鈣、變色硅膠或生石灰的廣口瓶?jī)?nèi)保存:濕接法制成的砂土管,用真空泵抽氣8~10小時(shí),使之干燥。放在盛有無(wú)水氯化鈣或變色硅膠的大試管內(nèi),加橡皮塞,放置4~6℃冰箱中貯藏。四)麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體,吸附接入孢子,然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法將麩皮與水以一定的比例1:(0.8~1.5)拌勻,裝量為試管體積2/5,濕熱滅菌后經(jīng)冷卻,接入新鮮培養(yǎng)的菌種,適溫培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中,于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏;干燥后也可將試管用火焰熔封,再保藏,則效果更好。此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌,保藏期在1年以上。因操作簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,工廠較多采用。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉,如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等,其保藏期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。五)、蒸餾水保藏法:這是保存斜面菌種和孢子最簡(jiǎn)單的方法,有效期可達(dá)1年以上。1、斜面蒸餾水貯藏:在無(wú)菌條件下,將無(wú)菌蒸餾水傾注入需保藏的斜面菌種內(nèi)。加水量需高出斜面頂端1~2厘米,更換無(wú)菌橡皮塞,直立置于4~6℃冰箱內(nèi)貯藏。2、孢子蒸餾水貯藏:無(wú)菌條件下提取少許孢子,移入試管無(wú)菌蒸餾水內(nèi),換上橡皮塞,直立置于4~6℃冰箱內(nèi)貯藏。若保存時(shí)間較長(zhǎng),中途需補(bǔ)充無(wú)菌蒸餾水。使用時(shí)從管內(nèi)挑取菌種塊或蘸取孢子懸液,移接至新的斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。原試管加塞后仍可繼續(xù)貯藏。六)、冷凍真空干燥保藏法1、安瓿瓶的準(zhǔn)備:

2、保護(hù)劑的選擇:3、冷凍干燥裝置:4、制備孢子液5、預(yù)凍孢子液:6、減壓干燥7、真空熔封:

六)、冷凍真空干燥保藏法

1、安瓿瓶的準(zhǔn)備:安瓿瓶的玻璃應(yīng)能經(jīng)受溫度的突變而不破裂,先用2%鹽酸浸泡12小時(shí),再用清水洗滌3次,然后用蒸餾水洗凈、烤干;瓶口加棉塞,滅菌后備用。

2、保護(hù)劑的選擇:保護(hù)劑的作用是使細(xì)胞在凍干過(guò)程中免受損傷及減少在保藏過(guò)程中的死亡。保護(hù)劑種類很多,如牛馬血清、無(wú)菌牛奶等,多數(shù)菌種保藏是脫脂牛奶。

3、冷凍干燥裝置:這個(gè)裝置包括1臺(tái)真空泵、1付麥?zhǔn)险婵沼?jì)、1個(gè)緩沖瓶、1個(gè)真空干燥器(內(nèi)裝五氧化二磷或無(wú)水氯化鈣等干燥劑)和1個(gè)冷凍槽(內(nèi)盛有1:3的食鹽和碎冰塊)。六)、冷凍真空干燥保藏法7、真空熔封:菌種安瓿瓶經(jīng)減壓干燥后,應(yīng)立即取出安裝在封口用的玻璃抽氣管上,進(jìn)行抽氣熔封管口。邊抽氣,邊用煤氣或酒精燈的細(xì)火焰,對(duì)準(zhǔn)安瓿瓶中央,即可熔斷封口。熔封時(shí)應(yīng)注意火焰,不宜過(guò)大。

安瓿瓶菌種啟用時(shí),在無(wú)菌操作下打開這瓿瓶,加入0.3~0.5毫升的無(wú)菌生理鹽水或1%麥芽汁即可使用。

由于真空干燥保藏的菌種是密封在安瓿瓶里的,因此不僅郵寄運(yùn)輸方便,并且不會(huì)污染雜菌。此法適于能形成孢子的菇類長(zhǎng)期保藏,其設(shè)備和操作均較復(fù)雜。

七)、液態(tài)氮超低溫保藏

將要保藏菌種的懸浮液或菌塊,密封于盛有保護(hù)劑的安瓿瓶里,先在控制的條件下致冷,使之緩速預(yù)凍,再置于-150至-196℃液態(tài)氮超低溫冰箱中保藏。優(yōu)點(diǎn):保存時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年至數(shù)十年;適用范圍廣,對(duì)一些即使不耐低溫菌種,如草菇等,也可在保護(hù)劑的保護(hù)下進(jìn)行超低溫保存;此外,經(jīng)保藏的菌種基本上不發(fā)生變異。國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)1、CCTCC中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,簡(jiǎn)稱CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、真菌、單細(xì)胞藻類、人和動(dòng)物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、雜交瘤、原生動(dòng)物,地衣,植物組織培養(yǎng)、植物種子、動(dòng)植物病毒、噬菌體、質(zhì)粒和基因文庫(kù)等各類微生物(生物材料/菌種)。/

國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)2、CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心:CGMCC的宗旨是廣泛收集國(guó)內(nèi)外的微生物資源,妥善保存,以公開的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前提下,為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù),最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。

國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)3、CICC中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心:我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心,保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括:細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌,共67個(gè)屬251種,近3000株,庫(kù)藏備份80000余支。/

國(guó)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)1、ATCC(AmericanTypeCultureCollection)美國(guó)典型菌種保藏中心:主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。該中心保藏有藻類111株,細(xì)菌和抗生素16865株,細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株,絲狀真菌和酵母46000株,植物組織79株,種子600株,原生動(dòng)物1800株,動(dòng)物病毒、衣原體和病原體2189株,植物病毒1563種。另外,該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。

國(guó)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)2、NBRC(NITEBiologicalResourceCenter):日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心

3、NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection):美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心

4、CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷蘭微生物菌種保藏中心

5、KCTC(KoreanCollectionforTypeCultures)韓國(guó)典型菌種保藏中心

6、DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroor

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