土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)廖

土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)廖第1頁/共35頁課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景二.研究思路三、微生物的計(jì)數(shù)四、設(shè)置對(duì)照：五.實(shí)驗(yàn)流程六.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與鑒定第2頁/共35頁一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+H2O+CO2NH3第3頁/共35頁3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌第4頁/共35頁1、實(shí)例：2、啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。發(fā)現(xiàn)：1996年在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)的。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。二.研究思路★為什么Taq細(xì)菌能從熱泉中被篩選出來？給了我們什么啟示？第5頁/共35頁2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：方法：利用選擇培養(yǎng)基人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。第6頁/共35頁15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4實(shí)例、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②此培養(yǎng)基的碳源是③此培養(yǎng)基的氮源是④從功能上看此培養(yǎng)基屬于哪類？葡萄糖尿素選擇培養(yǎng)基第7頁/共35頁1.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）（1）常用方法：稀釋涂布平板法。（2）原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。（3）過程：①選平板（選擇菌落數(shù)在30——300個(gè)菌落的三個(gè)平板）②統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的菌落數(shù)目取平均值③計(jì)算每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。三、微生物的計(jì)數(shù)除此外還有濾膜法第8頁/共35頁(4)現(xiàn)有一升水樣，用無菌吸管吸取1mL水樣至盛有9mL無菌水的試管中，依次稀釋103稀釋度。各取0.1mL已稀釋103倍的水樣分別接種到三個(gè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，記錄的菌落數(shù)分別為55、56、57，則每升原水樣中大腸桿菌數(shù)為________。(55＋56＋57)÷3÷0.1×103×103＝5.6×108。第9頁/共35頁注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。第10頁/共35頁※課本P22比較教材中兩位同學(xué)的操作方法，哪位同學(xué)的結(jié)果接近真實(shí)值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)呢？如需要，如何改進(jìn)？――第二位。兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)都需要改進(jìn)：第一位同學(xué)需設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)組，涂布至少3個(gè)平板；第二位同學(xué)統(tǒng)計(jì)的三個(gè)平板菌落數(shù)相差太大，說明操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第11頁/共35頁2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：抽樣檢測(cè)法利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)：第12頁/共35頁【對(duì)應(yīng)訓(xùn)練3】檢測(cè)員將1mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測(cè)的方法檢測(cè)每毫升藍(lán)藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計(jì)數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個(gè)計(jì)數(shù)室由25×16＝400個(gè)小格組成，容納液體的總體積為0.1mm3

現(xiàn)觀察到圖中該計(jì)數(shù)室所示a、b、c、d、e5個(gè)中格80個(gè)小格內(nèi)共有藍(lán)藻n個(gè)，則上述水樣中約有藍(lán)藻

個(gè)／mL。5n×105

原液所含細(xì)菌數(shù)/ml＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×l04×稀釋倍數(shù)第13頁/共35頁平板劃線法稀釋涂布平板法接種環(huán)涂布器分離技術(shù)平板劃線法稀釋涂布平板法。接種技術(shù)計(jì)數(shù)技術(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）：稀釋涂布平板法無菌技術(shù)消毒滅菌第14頁/共35頁設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。四、設(shè)置對(duì)照：實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))第15頁/共35頁小結(jié)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第16頁/共35頁五.細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)流程土壤取樣→制備培養(yǎng)基樣品稀釋→取樣涂布→微生物的培養(yǎng)→觀察并記錄結(jié)果→細(xì)菌計(jì)數(shù)第17頁/共35頁㈠.土壤取樣土壤中的微生物，大約70%-90%是細(xì)菌。細(xì)菌適宜在

的

潮濕土壤中生長(zhǎng)，絕大多數(shù)分布在距土表約3-8cm的土壤層。因此土壤取樣時(shí)，一般要鏟去

。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以

的選擇培養(yǎng)基。表層土酸堿度接近中性的尿素為唯一氮源第18頁/共35頁樣品稀釋度將直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)，分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：

。目的：

。[三]樣品的稀釋不同微生物在土壤中含量不同保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板細(xì)菌稀釋度選

。放線菌稀釋度

。真菌的稀釋度

。104105

106

103104105

102103104

第19頁/共35頁㈣.取樣涂布◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第20頁/共35頁㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔

統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取

的記錄作為結(jié)果?？梢苑乐挂蚺囵B(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落數(shù)目培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：

。放線菌：

。霉菌：

。30～37℃培養(yǎng)1～2d25～28℃培養(yǎng)5～7d25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d24h菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)第21頁/共35頁微生物的培養(yǎng)與觀察同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，這些特征包括

。菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面第22頁/共35頁（1）原理：

。因此可通過檢測(cè)pH的變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。（2）方法：以

的培養(yǎng)基中加入

指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌，若指示劑

，則pH升高，說明該種細(xì)菌能分解尿素。脲酶六.課題延伸——菌種的進(jìn)一步鑒定CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3；由于NH3的產(chǎn)生，培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)，pH升高，尿素為唯一氮源酚紅變紅第23頁/共35頁課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景二.研究思路三、微生物的計(jì)數(shù)四、設(shè)置對(duì)照：五.實(shí)驗(yàn)流程六.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與鑒定第24頁/共35頁判斷正誤

(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(

)。

(2)篩選分解尿素的細(xì)菌應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源(

)。

(3)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌一般用平板劃線法(

)。

(4)在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍(lán)，則說明篩選到分解尿素的細(xì)菌(

)。 答案(1)√

(2)√

(3)×

(4)×第25頁/共35頁（新課標(biāo)I）2017年普通高校招生統(tǒng)一考試37．[生物——選修1：生物技術(shù)實(shí)踐]（15分）某些土壤細(xì)菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用?；卮鹣铝袉栴}：（1）有些細(xì)菌能分解尿素，有些細(xì)菌則不能，原因是前者能產(chǎn)生_________________。能分解尿素的細(xì)菌不能以尿素的分解產(chǎn)物CO2作為碳源，原因是_________________，但可用葡萄糖作為碳源，進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的葡萄糖的主要作用是________（答出兩點(diǎn)即可）。（2）為了篩選可分解尿素的細(xì)菌，在配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)選擇________________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作為氮源，不選擇其他兩組的原因是____________________。（3）用來篩選分解尿素細(xì)菌的培養(yǎng)基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________（答出兩點(diǎn)即可）。【答案】（1）脲酶 分解尿素的細(xì)菌是異養(yǎng)型生物，不能利用CO2來合成有機(jī)物為細(xì)胞生物生命活動(dòng)提供能量，為其他有機(jī)物的合成提供原料（2）尿素 其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細(xì)菌和不能分解尿素的細(xì)菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用（3）為細(xì)菌生長(zhǎng)提供無機(jī)營(yíng)養(yǎng)，作為緩沖劑保持細(xì)胞生長(zhǎng)過程中pH穩(wěn)定第26頁/共35頁（新課標(biāo)I）2016年普通高校招生統(tǒng)一考試39.[生物——選修1]空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內(nèi)不同高度空氣中微生物的分布情況。實(shí)驗(yàn)步驟如下：①配置培養(yǎng)基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;②制作無菌平板；③設(shè)置空白對(duì)照組和若干實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行相關(guān)操作；④將各組平板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各組平板上菌落的平均數(shù)?；卮鹣铝袉栴}:（1）該培養(yǎng)基中微生物所需的氮來源于_________________。若要完成步驟②，該培養(yǎng)基中的成分X通常是_________________。（2）步驟③中，實(shí)驗(yàn)組的操作是_________________。（3）若在某次調(diào)查中，某一實(shí)驗(yàn)組平板上菌落平均數(shù)為36個(gè)/平板，而空白對(duì)照組的一個(gè)平板上出現(xiàn)了6個(gè)菌落，這種結(jié)果說明在此次調(diào)查中出現(xiàn)了_________________現(xiàn)象。若將30（即36-6）個(gè)/平板作為本組菌落數(shù)的平均值，該做法_______________（填“正確”或“不正確”）。第27頁/共35頁【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨瓊脂（2）將各實(shí)驗(yàn)組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開蓋暴露一段時(shí)間（3）污染不正確在完全正確的操作情況下，空白對(duì)照組中不應(yīng)出現(xiàn)菌落．若出現(xiàn)菌落，說明操作過程中存在微生物污染，屬于實(shí)驗(yàn)失誤，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均不應(yīng)采用．第28頁/共35頁（新課標(biāo)I）2015年普通高校招生統(tǒng)一考試39.[生物——選修1：生物技術(shù)實(shí)踐]（15分）已知微生物A可以產(chǎn)生油脂，微生物B可以產(chǎn)生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生產(chǎn)。回答有關(guān)問題：（1）顯微觀察時(shí)，微生物A菌體中的油脂通?？捎糜?/p>

染色。微生物A產(chǎn)生的油脂不易揮發(fā)，可選用

（填“萃取法”或“水蒸氣蒸餾法”）從菌體中提取。（2）為了從自然界中獲得能產(chǎn)生脂肪酶的微生物B的單菌落，可從含有油料作物種子腐爛物的土壤中取樣，并應(yīng)選用以

為碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（3）若要測(cè)定培養(yǎng)液中微生物B的菌體數(shù)，可在顯微鏡下用

直接計(jì)數(shù)；若要測(cè)定其活菌數(shù)量，可選用

法進(jìn)行計(jì)數(shù)。（4）為了確定微生物B產(chǎn)生的脂肪酶的最適溫度，某同學(xué)測(cè)得相同時(shí)間內(nèi)，在35℃、40℃、45℃溫度下降解10g油脂所需酶量依次為4mg、1mg、6mg，則上述三個(gè)溫度中，

℃條件下該酶活力最小。為了進(jìn)一步確定該酶的最適溫度，應(yīng)圍繞℃設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第29頁/共35頁【答案】（1）蘇丹III（或者蘇丹IV）萃取法油脂血細(xì)胞計(jì)數(shù)板稀釋涂布平板4540第30頁/共35頁（新課標(biāo)II）2014年普通高校招生統(tǒng)一考試選修1：為了調(diào)查某河流的水質(zhì)狀況，某講究小組測(cè)定了該河水流樣中的細(xì)菌含量，并進(jìn)行了細(xì)菌分離等工作。回答下列問題：（1）該小組采用稀釋涂布平板檢測(cè)水樣中的細(xì)菌含量。在涂布接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時(shí)間，這樣做的目的是__________;然后，將1mL水樣稀釋100倍，在3個(gè)平板上涂布法分別接入0.1mL稀釋液：經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為39、38、和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為__________。（2）該小組采用平板劃線法分離水樣中的細(xì)菌。操作時(shí)，接種環(huán)通過_______滅菌，在第二次及以后的劃線時(shí)，總是從上一次劃線的末端開始劃線。這樣做的目的是__________。（3）示意圖A和B中，__________表示的是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。(4)該小組將得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中并混勻，一部分進(jìn)行靜置培養(yǎng)，另一部分進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌比靜置培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)速度快。分析其原因是：震蕩培養(yǎng)能提高養(yǎng)液中__________的含量，同時(shí)可使用菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高_(dá)_________的利用率。第31頁/共35頁（1）檢測(cè)培養(yǎng)基平板滅菌是否合格3.8×107（2）灼燒；將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個(gè)菌落（3）B（4）溶解氧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)第32頁/共35頁（新課標(biāo)II）2013年普通高校招生統(tǒng)一考試臨床試用抗生素前，有時(shí)需要做細(xì)菌耐藥實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要從病人身上獲取少量樣本，然后按照一定的實(shí)驗(yàn)步驟操作，以確定某致病菌對(duì)不同抗生素的敏感性。 回答下列問題：（1）為了從樣本中獲取致病菌菌落，可用_______法或_________法將樣本接種種于固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)過選擇培養(yǎng)、鑒別等步驟獲得。（2）取