土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)廖

土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)廖第1頁/共35頁課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、課題背景二.研究思路三、微生物的計數(shù)四、設置對照：五.實驗流程六.土壤中分解尿素的細菌的分離與鑒定第2頁/共35頁一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO2NH3第3頁/共35頁3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌第4頁/共35頁1、實例：2、啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。發(fā)現(xiàn)：1996年在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)的。DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。二.研究思路★為什么Taq細菌能從熱泉中被篩選出來？給了我們什么啟示？第5頁/共35頁2、實驗室中微生物的篩選原理：方法：利用選擇培養(yǎng)基人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。第6頁/共35頁15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4實例、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②此培養(yǎng)基的碳源是③此培養(yǎng)基的氮源是④從功能上看此培養(yǎng)基屬于哪類？葡萄糖尿素選擇培養(yǎng)基第7頁/共35頁1.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）（1）常用方法：稀釋涂布平板法。（2）原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。（3）過程：①選平板（選擇菌落數(shù)在30——300個菌落的三個平板）②統(tǒng)計每個平板的菌落數(shù)目取平均值③計算每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。三、微生物的計數(shù)除此外還有濾膜法第8頁/共35頁(4)現(xiàn)有一升水樣，用無菌吸管吸取1mL水樣至盛有9mL無菌水的試管中，依次稀釋103稀釋度。各取0.1mL已稀釋103倍的水樣分別接種到三個培養(yǎng)基上培養(yǎng)，記錄的菌落數(shù)分別為55、56、57，則每升原水樣中大腸桿菌數(shù)為________。(55＋56＋57)÷3÷0.1×103×103＝5.6×108。第9頁/共35頁注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。④統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。第10頁/共35頁※課本P22比較教材中兩位同學的操作方法，哪位同學的結果接近真實值？你認為這兩位同學的實驗需要改進呢？如需要，如何改進？――第二位。兩位同學的實驗都需要改進：第一位同學需設置重復實驗組，涂布至少3個平板；第二位同學統(tǒng)計的三個平板菌落數(shù)相差太大，說明操作有誤，需要重新實驗。第11頁/共35頁2、顯微鏡直接計數(shù)：抽樣檢測法利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點：第12頁/共35頁【對應訓練3】檢測員將1mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測的方法檢測每毫升藍藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個計數(shù)室由25×16＝400個小格組成，容納液體的總體積為0.1mm3

現(xiàn)觀察到圖中該計數(shù)室所示a、b、c、d、e5個中格80個小格內(nèi)共有藍藻n個，則上述水樣中約有藍藻

個／mL。5n×105

原液所含細菌數(shù)/ml＝每小格平均細菌數(shù)×400×l04×稀釋倍數(shù)第13頁/共35頁平板劃線法稀釋涂布平板法接種環(huán)涂布器分離技術平板劃線法稀釋涂布平板法。接種技術計數(shù)技術顯微鏡直接計數(shù)法間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）：稀釋涂布平板法無菌技術消毒滅菌第14頁/共35頁設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。四、設置對照：實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))第15頁/共35頁小結：實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第16頁/共35頁五.細菌分離與計數(shù)的實驗流程土壤取樣→制備培養(yǎng)基樣品稀釋→取樣涂布→微生物的培養(yǎng)→觀察并記錄結果→細菌計數(shù)第17頁/共35頁㈠.土壤取樣土壤中的微生物，大約70%-90%是細菌。細菌適宜在

的

潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距土表約3-8cm的土壤層。因此土壤取樣時，一般要鏟去

。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以

的選擇培養(yǎng)基。表層土酸堿度接近中性的尿素為唯一氮源第18頁/共35頁樣品稀釋度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)，分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：

。目的：

。[三]樣品的稀釋不同微生物在土壤中含量不同保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板細菌稀釋度選

。放線菌稀釋度

。真菌的稀釋度

。104105

106

103104105

102103104

第19頁/共35頁㈣.取樣涂布◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第20頁/共35頁㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔

統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取

的記錄作為結果。可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落數(shù)目培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：

。放線菌：

。霉菌：

。30～37℃培養(yǎng)1～2d25～28℃培養(yǎng)5～7d25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d24h菌落數(shù)目穩(wěn)定時第21頁/共35頁微生物的培養(yǎng)與觀察同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，這些特征包括

。菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面第22頁/共35頁（1）原理：

。因此可通過檢測pH的變化來判斷該化學反應是否發(fā)生。（2）方法：以

的培養(yǎng)基中加入

指示劑，培養(yǎng)某種細菌，若指示劑

，則pH升高，說明該種細菌能分解尿素。脲酶六.課題延伸——菌種的進一步鑒定CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3；由于NH3的產(chǎn)生，培養(yǎng)基堿性增強，pH升高，尿素為唯一氮源酚紅變紅第23頁/共35頁課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、課題背景二.研究思路三、微生物的計數(shù)四、設置對照：五.實驗流程六.土壤中分解尿素的細菌的分離與鑒定第24頁/共35頁判斷正誤

(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(

)。

(2)篩選分解尿素的細菌應以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源(

)。

(3)統(tǒng)計樣品中的活菌一般用平板劃線法(

)。

(4)在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍，則說明篩選到分解尿素的細菌(

)。 答案(1)√

(2)√

(3)×

(4)×第25頁/共35頁（新課標I）2017年普通高校招生統(tǒng)一考試37．[生物——選修1：生物技術實踐]（15分）某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列問題：（1）有些細菌能分解尿素，有些細菌則不能，原因是前者能產(chǎn)生_________________。能分解尿素的細菌不能以尿素的分解產(chǎn)物CO2作為碳源，原因是_________________，但可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內(nèi)的葡萄糖的主要作用是________（答出兩點即可）。（2）為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養(yǎng)基時，應選擇________________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作為氮源，不選擇其他兩組的原因是____________________。（3）用來篩選分解尿素細菌的培養(yǎng)基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________（答出兩點即可）?！敬鸢浮浚?）脲酶 分解尿素的細菌是異養(yǎng)型生物，不能利用CO2來合成有機物為細胞生物生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料（2）尿素 其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用（3）為細菌生長提供無機營養(yǎng)，作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩(wěn)定第26頁/共35頁（新課標I）2016年普通高校招生統(tǒng)一考試39.[生物——選修1]空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內(nèi)不同高度空氣中微生物的分布情況。實驗步驟如下：①配置培養(yǎng)基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;②制作無菌平板；③設置空白對照組和若干實驗組，進行相關操作；④將各組平板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時間，統(tǒng)計各組平板上菌落的平均數(shù)?；卮鹣铝袉栴}:（1）該培養(yǎng)基中微生物所需的氮來源于_________________。若要完成步驟②，該培養(yǎng)基中的成分X通常是_________________。（2）步驟③中，實驗組的操作是_________________。（3）若在某次調(diào)查中，某一實驗組平板上菌落平均數(shù)為36個/平板，而空白對照組的一個平板上出現(xiàn)了6個菌落，這種結果說明在此次調(diào)查中出現(xiàn)了_________________現(xiàn)象。若將30（即36-6）個/平板作為本組菌落數(shù)的平均值，該做法_______________（填“正確”或“不正確”）。第27頁/共35頁【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨瓊脂（2）將各實驗組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開蓋暴露一段時間（3）污染不正確在完全正確的操作情況下，空白對照組中不應出現(xiàn)菌落．若出現(xiàn)菌落，說明操作過程中存在微生物污染，屬于實驗失誤，所有實驗數(shù)據(jù)均不應采用．第28頁/共35頁（新課標I）2015年普通高校招生統(tǒng)一考試39.[生物——選修1：生物技術實踐]（15分）已知微生物A可以產(chǎn)生油脂，微生物B可以產(chǎn)生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生產(chǎn)。回答有關問題：（1）顯微觀察時，微生物A菌體中的油脂通常可用于

染色。微生物A產(chǎn)生的油脂不易揮發(fā)，可選用

（填“萃取法”或“水蒸氣蒸餾法”）從菌體中提取。（2）為了從自然界中獲得能產(chǎn)生脂肪酶的微生物B的單菌落，可從含有油料作物種子腐爛物的土壤中取樣，并應選用以

為碳源的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。（3）若要測定培養(yǎng)液中微生物B的菌體數(shù)，可在顯微鏡下用

直接計數(shù)；若要測定其活菌數(shù)量，可選用

法進行計數(shù)。（4）為了確定微生物B產(chǎn)生的脂肪酶的最適溫度，某同學測得相同時間內(nèi)，在35℃、40℃、45℃溫度下降解10g油脂所需酶量依次為4mg、1mg、6mg，則上述三個溫度中，

℃條件下該酶活力最小。為了進一步確定該酶的最適溫度，應圍繞℃設計后續(xù)實驗。第29頁/共35頁【答案】（1）蘇丹III（或者蘇丹IV）萃取法油脂血細胞計數(shù)板稀釋涂布平板4540第30頁/共35頁（新課標II）2014年普通高校招生統(tǒng)一考試選修1：為了調(diào)查某河流的水質(zhì)狀況，某講究小組測定了該河水流樣中的細菌含量，并進行了細菌分離等工作。回答下列問題：（1）該小組采用稀釋涂布平板檢測水樣中的細菌含量。在涂布接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時間，這樣做的目的是__________;然后，將1mL水樣稀釋100倍，在3個平板上涂布法分別接入0.1mL稀釋液：經(jīng)適當培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為39、38、和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為__________。（2）該小組采用平板劃線法分離水樣中的細菌。操作時，接種環(huán)通過_______滅菌，在第二次及以后的劃線時，總是從上一次劃線的末端開始劃線。這樣做的目的是__________。（3）示意圖A和B中，__________表示的是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結果。(4)該小組將得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中并混勻，一部分進行靜置培養(yǎng)，另一部分進行震蕩培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)：振蕩培養(yǎng)的細菌比靜置培養(yǎng)的細菌生長速度快。分析其原因是：震蕩培養(yǎng)能提高養(yǎng)液中__________的含量，同時可使用菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高__________的利用率。第31頁/共35頁（1）檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格3.8×107（2）灼燒；將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個菌落（3）B（4）溶解氧營養(yǎng)物質(zhì)第32頁/共35頁（新課標II）2013年普通高校招生統(tǒng)一考試臨床試用抗生素前，有時需要做細菌耐藥實驗。實驗時，首先要從病人身上獲取少量樣本，然后按照一定的實驗步驟操作，以確定某致病菌對不同抗生素的敏感性。 回答下列問題：（1）為了從樣本中獲取致病菌菌落，可用_______法或_________法將樣本接種種于固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)過選擇培養(yǎng)、鑒別等步驟獲得。（2）取