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特殊顯微鏡的使用第1頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六暗視野顯微鏡原理:暗視野顯微鏡在構(gòu)造上應(yīng)用了丁達(dá)爾現(xiàn)象,在聚光鏡中央有擋光片,不能直接觀察到照明光線,只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入視野,因而視野的背景是黑的,物理的邊緣是亮點(diǎn)。視場(chǎng)內(nèi)被斜射光線照明,即通過(guò)樣品各種結(jié)構(gòu)表面散射和反射光線,看到許多細(xì)胞器的明亮輪廓,如細(xì)胞核、線粒體和液泡等。第2頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六優(yōu)點(diǎn):分辨率比普通顯微鏡高50倍。缺點(diǎn):不能辨別細(xì)微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用:在某些細(xì)菌、細(xì)菌等活體檢查中常常使用暗視野顯微鏡。常用的暗視野照明法:中心遮光法暗視野聚光法第3頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六相差顯微鏡光的三要素:波長(zhǎng)、振幅、相位20世紀(jì)30年代初,德國(guó)物理學(xué)家澤尼克(Zernike)根據(jù)“相襯法”原理,于1932年制造出了世界上第一臺(tái)相差顯微鏡,并因此獲得1953年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。第4頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六相差顯微鏡1原理:當(dāng)照明光線通過(guò)活細(xì)胞時(shí),雖然波長(zhǎng)及振幅沒(méi)有明顯的變化,但由于細(xì)胞的各部分及細(xì)胞與周圍介質(zhì)之間折射率有所差別,光波透過(guò)后可產(chǎn)生相位的變化。光線通過(guò)各種界面時(shí),一部分仍為相位和振幅相同的直射光,另一部分由于光的衍射現(xiàn)象而向周圍發(fā)散成衍射光。衍射光與直射光的波長(zhǎng)一致,但相位不同。第5頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六一般衍射光的相位比直射光推遲約1/4λ,同時(shí)到達(dá)一點(diǎn)時(shí),兩者相互干涉,形成合成光,其強(qiáng)度取決于兩光波的振幅和相位差。在相差顯微鏡中,通過(guò)相板和環(huán)狀光闌改變衍射光或直射光的相位,將直射光和衍射光的相位差變成振幅差。如果推遲直射光的相位1/4λ,則直射光和衍射光的相位相同,發(fā)生相長(zhǎng)干涉,合成光有2倍的振幅,樣品最為明亮,稱復(fù)反差。第6頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六如果推遲衍射光的相位1/4λ,則直射光比衍射光超前1/2λ,這時(shí)發(fā)生相消干涉,即波峰與波谷相遇,合成光比直射光暗,成正反差。一般生物樣品中各種結(jié)構(gòu)推遲光程的能力不同,但都在上述兩個(gè)極端之間,這樣就會(huì)出現(xiàn)明暗程度的不同。第7頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六步驟:1、相差顯微鏡的調(diào)試(1)光路調(diào)中:光路中心和照明光束的中心合一、聚光器調(diào)中的步驟為:1,把聚光鏡調(diào)到最高位置;2,開(kāi)啟光源;3,轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán),使“O”進(jìn)入標(biāo)示孔;4,低倍鏡聚焦樣品;5,縮小視野光闌,在顯微鏡的視野里可見(jiàn)視場(chǎng)光闌的模糊圖像;6,微降調(diào)聚光器使視場(chǎng)光闌的像清晰。第8頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六7,雙手調(diào)節(jié)聚光器的兩個(gè)調(diào)中螺桿,使視場(chǎng)中心移至視野中央。8,開(kāi)放視場(chǎng)光闌,使其周邊與視野周邊相接,形成視野的內(nèi)接多邊形,如不能內(nèi)接,則重復(fù)步驟7和89,使聚光器升至頂點(diǎn),光路調(diào)中即告完成。(2)合軸調(diào)節(jié)在設(shè)計(jì)上,相差顯微鏡的共軛面的直徑和寬度與環(huán)狀光闌與相板共軛面的透光環(huán)是一致的,使用時(shí),每一相差顯微鏡必與環(huán)狀光闌相匹配,還要調(diào)節(jié)兩環(huán),使其合軸。調(diào)節(jié)方法:1,從目鏡筒中拔出目鏡;第9頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六2,插入合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡,轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡上面的螺旋,使其升降(不要從目鏡筒中拔出望遠(yuǎn)鏡),至兩環(huán)清晰為止。3,雙手輕按轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌調(diào)中螺桿并轉(zhuǎn)動(dòng),使環(huán)狀光闌移到環(huán)狀光闌與相板共軛面完全重合為止。4,如果環(huán)狀光闌的大小與相板的大小不完全一致,升降聚光器,使之一致。5,拔出望遠(yuǎn)鏡,換入目鏡后即可開(kāi)始做鏡檢觀察,環(huán)狀光闌也應(yīng)做相應(yīng)轉(zhuǎn)換。第10頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六兩種不同類型的光學(xué)顯微鏡所拍攝的圖像比較第11頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六熒光顯微鏡原理:熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡可以共用一些部件(如機(jī)架等)熒光顯微鏡是利用一定波長(zhǎng)的光(通常是紫外光或藍(lán)紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì),使之發(fā)出熒光,呈現(xiàn)熒光影像。熒光顯微鏡包括光源、濾片系統(tǒng)和顯微鏡三個(gè)部分。第12頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六第13頁(yè),共16頁(yè),2023年,2月20日,星期六熒光顯微鏡
在光鏡水平上,借助于標(biāo)記熒光素或激發(fā)熒光,對(duì)細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類等組分進(jìn)行定性定位觀察。激發(fā)光源濾光片系統(tǒng):核心部件:專用的物鏡鏡頭和濾光片系統(tǒng)激發(fā)濾光片(安裝在光源和樣品之間,只允許特定波長(zhǎng)的激光通過(guò))阻斷濾光片(安裝在物鏡和目鏡之間,只容許熒光染料所發(fā)出的熒光通過(guò))熒光染料DAPI特異性結(jié)合細(xì)胞中DNAGFP蛋白與編碼蛋白基因融合熒光素直接標(biāo)記技術(shù)和免疫熒
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