第十章 核酸分子雜交技術(shù)

第十章核酸分子雜交技術(shù)

第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子一、DNA變性與復(fù)性

（一）DNA變性1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈階梯式曲線5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3（二）復(fù)性1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子3、復(fù)性的速率方程（服從二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)）dCdt=K2C2（1）將（1）積分CCo11+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復(fù)性時(shí)，（2）式中的為121211+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=

二、影響雜交的因素1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃3、離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在68℃雜交

5、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度（2）Cot?與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比（3）兩個(gè)DNA樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于DNA的相對(duì)復(fù)雜性6、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

第二節(jié)核酸分子雜交的方法按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相雜交膜上印跡雜交原位雜交液相雜交

RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法

一、Southern印跡雜交（一）待測(cè)核酸樣品的制備1、裂解或破碎細(xì)胞2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快，大小相同的分子處于同一條帶3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液

（四）Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機(jī)械性能

非特異吸附少（2）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較上述兩種膜低2、Southern印跡的常用方法

（1）毛細(xì)管虹吸印跡法利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上毛細(xì)管虹吸印跡法示意圖（2）電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。電轉(zhuǎn)法示意圖（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。真空轉(zhuǎn)移法示意圖（五）Southern雜交1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA

（六）雜交結(jié)果檢測(cè)1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1、酶切圖譜分析2、特定基因定性和定量3、基因突變分析4、限制性片段長度多態(tài)性的分析二、Northern印跡雜交1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交1、斑點(diǎn)印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交保持組織細(xì)胞的形態(tài)對(duì)核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2、雜交過程：（1）組織或細(xì)胞的固定理想固定液應(yīng)具備：（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋