第十章 核酸分子雜交技術(shù)

第十章核酸分子雜交技術(shù)

第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理

具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子一、DNA變性與復(fù)性

（一）DNA變性1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈階梯式曲線5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3（二）復(fù)性1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子3、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學(xué)）dCdt=K2C2（1）將（1）積分CCo11+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（2）式中的為121211+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=

二、影響雜交的因素1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃3、離子強度：（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交

5、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度（2）Cot?與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比（3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性6、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

第二節(jié)核酸分子雜交的方法按待測核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相雜交膜上印跡雜交原位雜交液相雜交

RNA酶保護分析法核酸酶S1保護分析法

一、Southern印跡雜交（一）待測核酸樣品的制備1、裂解或破碎細胞2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段（二）待測DNA樣品的電泳分離1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液

（四）Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機械性能

非特異吸附少（2）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高③化學(xué)活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能力較上述兩種膜低2、Southern印跡的常用方法

（1）毛細管虹吸印跡法利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上毛細管虹吸印跡法示意圖（2）電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。電轉(zhuǎn)法示意圖（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。真空轉(zhuǎn)移法示意圖（五）Southern雜交1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA

（六）雜交結(jié)果檢測1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1、酶切圖譜分析2、特定基因定性和定量3、基因突變分析4、限制性片段長度多態(tài)性的分析二、Northern印跡雜交1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA三、斑點及狹縫印跡雜交1、斑點印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交保持組織細胞的形態(tài)對核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對雜交信號無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2、雜交過程：（1）組織或細胞的固定理想固定液應(yīng)具備：（2）組織細胞雜交前的預(yù)處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋