進出口危險化學品安全試驗方法 第27部分：流式細胞術(shù)檢測凋亡

進出口危險化學品安全試驗方法第27部分：流式細胞術(shù)檢測凋亡SN/T2497的本部分規(guī)定了進出口危險化學品流式細胞術(shù)檢測測亡的術(shù)語和定義、試驗方法和結(jié)果分析。本部分適用于進出口危險化學品流式細胞術(shù)檢測調(diào)亡的試驗。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本部分。也稱為“程序性細胞死亡”,是一種細胞受環(huán)境刺激后，在基因調(diào)控之下所產(chǎn)生的自然死亡現(xiàn)象。調(diào)亡最初由特征性的形態(tài)變化來確定，包括，DNA的程序性降解、染色質(zhì)濃縮、細胞縮小和碎裂。它可以是生理性的，或由化療藥物及放射誘發(fā)?；铙w內(nèi)局部組織、細胞的死亡稱為壞死。壞死組織細胞的代謝停止，功能喪失。壞死的形態(tài)變化可以是由損傷細胞內(nèi)的水解酶的降解作用引起，也可以由游走來的白細胞釋放的水解酶的作用引起。流式細胞術(shù)flawcytometry是用流式細胞儀測量液相中懸浮細胞或微粒的物理性質(zhì)及化學性質(zhì)，如細胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA,蛋白質(zhì)、抗原等進行快速測定并可分類收集的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。3試驗方法3.1儀器設備——流式細胞儀：——普通低速離心機：——漩渦混勻儀；——微量加樣器。3.2試劑和耗材——AnnexinV/PI試劑盒(含熒光標記的AnnexinV,PI和BindingBuffer):—-200目過濾尼龍網(wǎng)：——0.22μm的濾膜；——PBS緩沖液(pH=7.4)和蒸餾水(用濾器濾過);——流式細胞儀的保養(yǎng)試劑；——加樣槍頭。試劑如自行配置，PBS和BingdingBuffer和PI的配置可以參見附錄A。3.3試驗步驟3.3.1細胞懸液的制備試驗所用細胞可來源于各種組織也可為直接培養(yǎng)的細胞。若細胞來源于組織，需將其充分分離，并用200目尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞懸液。將細胞用PBS緩沖液洗滌兩次[(500～800)r/min,5min/次],調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL,根據(jù)試驗目的進行分組。要包含對照組，包括未標記的細胞，僅用AnnexinV標記的細胞，僅用PI染色的細胞。3.3.3染色(如果使用試劑盒·加入試劑的劑量可以按說明書進行)a)取100pL(1×10°個細胞)到5mL.流式加樣管中；b)加入熒光標記的AnnexinV試劑5μl.至上述管中；c)加人PI染料10gL.入加樣管中[PI的加入量可以根據(jù)不同的目的細胞和試驗方案進行調(diào)整，加入量可在(2～10)pL./管進行調(diào)整];d)輕輕搖動細胞，避光，室溫保存15min。3.3.4上機檢測a)在管中加入400pl的1×BindingBuffer(也可按照試劑盒的說明進行使用);b)在1h上流式細胞儀進行分析(選擇相應的模塊)。4試驗結(jié)果4.1不同階段細胞的表型由于細胞花絲期間也可以出現(xiàn)PS(膜磷脂酰絲氨酸》的外露，AnnexinV應與檢測細胞活性的染料PI聯(lián)合后用來區(qū)分不同細胞，結(jié)果見表1。4十4.2數(shù)據(jù)處理選用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法對試驗結(jié)果進行分析，判斷受試物是否能引起凋亡，及在不同濃度下的調(diào)亡的差別是否有統(tǒng)計學意義。A.1PBS的配置NaONa?HPO?·7H?ONaCl用1×PBS