原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用

形態(tài)功能學(xué)技術(shù)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。1.兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子2.應(yīng)用帶有標(biāo)記的〔有放射性同位素，如3H、35S、32P，熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì))DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸(RNA或DNA〕片段進(jìn)行雜交3.用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位

Aromasegene

TheratbrainsectionInsituhybridization培養(yǎng)細(xì)胞由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman〔1981〕等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer〔1982〕報(bào)道用2，4二硝基苯甲醛〔DNP〕標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識(shí)別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。核酸探針的分類核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA〔Singlestranded,ssDNA〕和雙鏈DNA〔Doublestranded,dsDNA〕之分。早期應(yīng)用的主要是DNA探針Temin在70年代研究致癌RNA病毒時(shí)制備了cDNA探針〔complementaryDNA〕，其根本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶〔reversetranscriptase〕又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動(dòng)子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針〔Senseprobe〕和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針〔antisenseprobe〕，又稱互補(bǔ)RNA探針〔complementaryRNAprobe,cRNA〕。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對(duì)照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反響極高。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號(hào)高。大致可分為：①雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示〔visualization〕：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色?！惨弧彻潭骖櫲齻€(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對(duì)于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對(duì)RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。對(duì)于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣枯燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè)DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過程中可減低mRNA的含量?！捕巢Ｆ徒M織切片的處理1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，枯燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。近年VectorLab(U.S.A.)推出一種新的粘附劑叫VectorbandReagent,每一單位包裝可制備500～700張載玻片，粘附效果極佳，價(jià)格較多聚賴氨酸廉價(jià)，制片后可長(zhǎng)期保存應(yīng)用。2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長(zhǎng)度而定。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑〔detergent〕或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶〔diastase〕等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。蛋白酶K〔ProteinaseK〕:1μg/ml(于0.1mol/lTris/50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以到達(dá)充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液〔在PBS中〕清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等〔1987〕報(bào)告應(yīng)用胃蛋白酶〔Pepsin〕20～100μg/ml〔用0.1nHCl配〕37℃、30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。3．減低背景染色雜交后〔Posthybridization〕的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預(yù)雜交〔Prehybridization〕是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖〔Dextransulphate〕。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可到達(dá)封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。4．防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫〔240℃〕烘烤以到達(dá)消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理?！踩畴s交〔Hybridisation〕雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫〔50℃左右〕導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附到達(dá)覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。為保證雜交所需的濕潤(rùn)環(huán)境，放在濕盒中進(jìn)行孵育。本卷須知1．探針的濃度很難事先確定，但要掌握一個(gè)原那么，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信/噪比值。非放射性標(biāo)記〔生物素或地高辛〕探針濃度為0.5～5.0μg/ml〔即0.5～5.0ng/μl〕。放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針濃度在2～5ng/μl。必須強(qiáng)調(diào)的是，加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。2．探針的長(zhǎng)度一般應(yīng)用于ISHH探針的最正確長(zhǎng)度應(yīng)在50～100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短?！菜摹畴s交后處理〔posthybridisationtreatment〕雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對(duì)RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原那么是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片枯燥?！参濉筹@示〔Visualization〕顯示又可稱為檢測(cè)系統(tǒng)〔Detectionsystem〕。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀〔computer–assistedimageanalysis〕檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀對(duì)不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)?！擦硨?duì)照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷和其它實(shí)驗(yàn)方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號(hào)都是特異性的，故必須同時(shí)有對(duì)照試驗(yàn)以證明其特異性。對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對(duì)照試驗(yàn)有以下幾種ISHH對(duì)照試驗(yàn)一覽表核乳膠或非放射性檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)照試驗(yàn)Northern或Southern印跡雜交法ISHH與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合應(yīng)用多種不同的核苷酸探針與同一靶核酸進(jìn)行雜交將cDNA或cRNA探針進(jìn)行預(yù)雜交〔吸收試驗(yàn)〕與非特異性〔載體〕序列和不相關(guān)探針雜交〔置換試驗(yàn)〕將切片應(yīng)用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交應(yīng)用同義RNA探針〔Senseprobe〕進(jìn)行雜交以不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交〔空白試驗(yàn)〕組織對(duì)照用確定為陽性或陰性組織進(jìn)行ISHH對(duì)照應(yīng)用未標(biāo)記探針做ISHH，進(jìn)行對(duì)照ISHH的最大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，它可測(cè)定組織、培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)mRNA，其敏感度可到達(dá)20個(gè)mRNA拷貝/每個(gè)細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時(shí)很少發(fā)生喪失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長(zhǎng)于2kb的探針可以應(yīng)用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時(shí)甚至在組織切片上的單個(gè)基因拷貝。正因?yàn)槿绱?，?duì)ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報(bào)告過的新發(fā)現(xiàn)。因?yàn)槿缜八觯绊慖SHH實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素太多，比方在外科或?qū)嶒?yàn)取材后未及時(shí)的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。另外，在各種類型核酸探針進(jìn)入細(xì)胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性〔acessiblity〕各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。原位雜交操作流程15〕雜交；第二天

16〕將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；

17〕PBS清洗3分鐘；

18〕RNA酶溶液中〔或0.1-1ng/mlPBS中〕，37℃孵育30分鐘；

19〕PBS清洗5分鐘；

20〕室溫，2×SSC清洗10分鐘；

21〕37℃，1×SSC清洗10分鐘；

22〕37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；

23〕緩沖液孵育10分鐘；

24〕緩沖液〔1%正常綿羊血清和0.03%TritonX-100〕孵育30分鐘；

25〕參加抗地高辛抗體，37℃孵育3小時(shí)；

26〕緩沖液清洗2次，每次10分鐘；

27〕緩沖液清洗2次，每次5分鐘；

28〕制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到16小時(shí)；

29〕停止緩沖液的反響，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；

30〕固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。

15〕雜交；第二天

16〕將玻片置于SSC中以去除封片；

17〕室溫，2×SSC清洗10分鐘；

18〕37℃，1×SSC清洗10分鐘；

19〕37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；

20〕緩沖液孵育10分鐘；

21〕緩沖液孵育30分鐘；

22〕參加抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí)；

23〕緩沖液清洗2次，每次5分鐘；

24〕緩沖液清洗2次，每次5分鐘；

25〕制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長(zhǎng)到16小時(shí)；

26〕停止緩沖液的反響，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；

27〕固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。

成年大鼠海馬、齒狀回DAT1mRNA陽性神經(jīng)元

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