食品微生物學(xué)實驗指導(dǎo)

1、食 品 微 生 物 學(xué) 實 驗 指 導(dǎo)(羅軍 賴建平)南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物學(xué)系2009年10月前 言食品是人類賴以生存的必要條件。食品安全問題是關(guān)系到人的生命健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的重要問題。據(jù)WHO數(shù)據(jù)估計，全球每年報告食源性疾病發(fā)病病例數(shù)達十億例，其中80%由微生物引起。老百姓對食品衛(wèi)生的要求是越來越高，國家針對食品安全的法制化建設(shè)步伐正在加快。1995年正式頒布中華人民共和國食品衛(wèi)生法，為搞好品衛(wèi)生工作，保證食品質(zhì)量提供了法律依據(jù)，2007年10月31日，國務(wù)院討論并通過中華人民共和國食品安全法，并于2008年4月20日向社會公布。食品微生物學(xué)是食品安全與質(zhì)量專業(yè)的一門專

2、業(yè)基礎(chǔ)學(xué)科，它主要研究食品中有害微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、致病性、檢測和預(yù)防，以及有益微生物的應(yīng)用和發(fā)展，為食品生產(chǎn)，食品衛(wèi)生提供理論依據(jù)。而食品微生物學(xué)實驗課的實施則可提供給學(xué)生豐富和加深理論知識，獲得感性認(rèn)識，增強動手能力的機會和場所，同時，通過實驗，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問題和解決問題的能力；實事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度以及勤儉節(jié)約、愛護公物的良好作風(fēng)。掌握食品微生物檢驗技術(shù)是食品從業(yè)人員和食品衛(wèi)生監(jiān)督者的神圣職責(zé)；是貫徹執(zhí)行食品衛(wèi)生法，提高食品質(zhì)量必不可少的技術(shù)保證；是保證食品安全衛(wèi)生的重要手段。目前，高校培養(yǎng)的食品安全專業(yè)人才，多為生產(chǎn)與加工環(huán)節(jié)需求的理工科人才，在面對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時

3、，普遍缺乏應(yīng)急反應(yīng)能力，不能對突發(fā)事件做出科學(xué)快速的處理，我們根據(jù)預(yù)防醫(yī)學(xué)食品安全專業(yè)學(xué)生的培養(yǎng)要求，制訂相應(yīng)的課程培養(yǎng)目標(biāo)，通過開展食源性疾病檢測綜合性實驗，重點加強學(xué)生應(yīng)急反應(yīng)能力培養(yǎng)，如接報衛(wèi)生事件后正確處理能力、根據(jù)不同狀況采集足夠證據(jù)能力、現(xiàn)場調(diào)查分析能力、流行病調(diào)查統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)能力、生物安全防范操作能力、微生物實驗檢驗?zāi)芰?、綜合分析報告能力、防止事件擴大化等能力。本教材力求突出應(yīng)急型公共衛(wèi)生人才培養(yǎng)特色，以適應(yīng)社會工作的需求，內(nèi)容符合“特色、實用、創(chuàng)新”的原則，既注重基本理論和基本技術(shù)的系統(tǒng)性，又突出重點，突出實用性。增加了食源性疾病暴發(fā)的調(diào)查和控制內(nèi)容，首次將流行病學(xué)、衛(wèi)生法學(xué)、

4、食品安全與控制學(xué)、衛(wèi)生管理學(xué)等理論實驗知識進行整合，側(cè)重于食源性疾病暴發(fā)應(yīng)急處理能力所需基本技能的實際操作與演練。并對食品微生物檢驗實驗室管理內(nèi)容作了介紹。附錄包括培養(yǎng)基、常用試劑、及調(diào)查分析的背景資料。由于編者水平有限、時間倉促，書中難免有疏漏與不妥之處，敬請同行和廣大讀者批評指正。二、學(xué)生缺乏面對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時的應(yīng)急反應(yīng)能力食品微生物學(xué)教學(xué)，缺乏對學(xué)生的應(yīng)急反應(yīng)能力的培養(yǎng)，在應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時，三、三、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急能力的培養(yǎng)四、本書的編排本書分六個部分，第一部分是實用準(zhǔn)則，簡述暴發(fā)調(diào)查和控制的步驟，重點介紹工作計劃和準(zhǔn)備、食源性疾病暴發(fā)的監(jiān)測、調(diào)查、控制措施和食源性疾病原體

5、的檢測。五、實驗?zāi)康谋窘滩脑趯嶒灳幣派希⒅貙嶒灥目茖W(xué)性、實用性及連貫性。積極調(diào)動學(xué)生的能動性，盡量增加學(xué)生動手機會，讓學(xué)生先從掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌入手，隨后用自己所配制的培養(yǎng)基進行接種分離，通過顯微觀察獲得對微生物的感性認(rèn)識；通過生化試驗、菌落總數(shù)測定及大腸菌群測定等試驗熟練并掌握食品微生物學(xué)的操作和檢驗技術(shù)。此外，還安排學(xué)生赴野外進行真菌的采集，初步認(rèn)識和生態(tài)考察，豐富視野。調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的主動性、積極性、創(chuàng)造性，重視學(xué)生能力的培養(yǎng)是當(dāng)今教學(xué)改革的主旋律。作為一名教師，不僅要傳授最基本、最核心的理論知識，更重要的是應(yīng)努力教給學(xué)生如何提高能力。能力主要包括自學(xué)能力(查閱文獻資料能力)、科學(xué)思

6、維能力(分析、綜合、想象和創(chuàng)造能力)、動手能力(實驗設(shè)計和基本操作能力)、表達能力(語言、文字、圖表及整理統(tǒng)計能力)等。有鑒于此，本書在教學(xué)內(nèi)容改革上作了一些大膽的嘗試：一、改變“實驗課驗證課堂理論”的傳統(tǒng)做法，開設(shè)綜合性實驗傳統(tǒng)的實驗課教學(xué)模式是，每講完一個或幾個章節(jié)的理論知識后就安排一次實驗課，主要是驗證課堂理論，而學(xué)生真正動手、動腦機會較少，不利于學(xué)生能力培養(yǎng)。因此，我們將實驗課程獨立出來，減少驗證性和重復(fù)性實驗，將以往零散的單一的實驗重新編排成實踐性、目的性很強的綜合性實驗，集中時間進行。綜合性實驗涵蓋了要求學(xué)生掌握的微生物學(xué)基本技能，同時納入了一些新方法，展示了一次科學(xué)實驗的全過程，

7、給學(xué)生獨立設(shè)計和完成一個實驗的機會，大大增加了學(xué)生動手機會。實驗結(jié)束，要求學(xué)生按照科研論文格式撰寫實驗論文。二、為拓寬學(xué)生知識面，啟迪思維，精心編寫補充教材，主要內(nèi)容有：1.微生物學(xué)基礎(chǔ)實驗。2.食品微生物學(xué)綜合性實驗。3.研究、創(chuàng)新性實驗。4.綜合性、研究、創(chuàng)新性實驗的實驗報告及科研論文的撰寫方法。六、因此，針對食源性疾病快速檢測技術(shù)不斷發(fā)展，但是，現(xiàn)行培養(yǎng)的公共衛(wèi)生監(jiān)督人員，對于食源性疾病的暴發(fā)的調(diào)查與控制技術(shù)還不能全面掌握，因為涉及到臨床醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、實驗醫(yī)學(xué)、食品微生物學(xué)、食品化學(xué)、食品安全與控制等多方面的技術(shù)，這些技術(shù)又都是獨立的，分割的條塊知識，未經(jīng)整合的實驗體系已不能滿足突發(fā)公

8、共衛(wèi)生事件時，對學(xué)生應(yīng)急能力的培養(yǎng)要求。本書重點培養(yǎng)學(xué)生的應(yīng)急能力， 的隨著科學(xué)發(fā)展，食品科學(xué)領(lǐng)域中微生物的應(yīng)用也越來越廣泛，無論是食品生產(chǎn)、加工、儲藏、銷售和食用的任一環(huán)節(jié)，都要求食品專業(yè)人員正確掌握微生物學(xué)的基本理論和基本操作。近年來，食源性疾病的暴發(fā)的調(diào)查與控制涉及到多個部門的工作，需要微生物技術(shù)發(fā)展很快，伴隨著許多商品化培養(yǎng)和試劑的推出以及儀器和工具的改進，許多微生物實驗方法已從過去繁、費時的工作中解脫出來。本教材除保留現(xiàn)今生產(chǎn)和科研中常應(yīng)用的一些經(jīng)典方法和器材外，還補充了近年來推薦和應(yīng)用的一些方法，比如；將適用于現(xiàn)場檢測食品和餐具的快速檢測大腸菌群的紙片法與傳統(tǒng)方法共同試驗和比較；在

9、糖發(fā)酵管作比較等。限于編者的水平，本書中錯漏在所難免，歡迎廣大讀者指正，以便再版時改進。編者2006年09月 實驗須知微生物學(xué)實驗課是一門操作技能很強的課程。對每一個微生物學(xué)工作者來說，其重要性決不亞于理論課程，兩者的關(guān)系猶如大鵬的一對強勁翅膀，沒有它們間的協(xié)同，就無法在廣闊的藍天中自由翱翔。實驗課教學(xué)的主要目標(biāo)是，使學(xué)生了解食品微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，樹立牢固的無菌觀念，更重要的是培養(yǎng)學(xué)生自學(xué)能力、科學(xué)思維能力、動手能力和表達能力。為保證實驗效果和實驗室的安全，我們根據(jù)微生物學(xué)實驗工作的特點，提出如下幾點注意事項：一、學(xué)生在實驗課前，應(yīng)充分預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容，明確實驗

10、目的，了解實驗原理、方法和注意事項。二、進入實驗室必須穿白大褂。每次實驗前須用濕布擦凈臺面，并洗手，以減少染菌的機會。盡量不帶個人生活、學(xué)習(xí)用品進入實驗室，必須要帶的書本、文具等應(yīng)放在遠離實驗操作的指定位置。三、嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，防止雜菌污染。萬一遇到盛菌試管或瓶不慎打破而污染皮膚、衣物、桌面等意外情況，應(yīng)立即報告指導(dǎo)教師，及時處理，切勿隱瞞。用過的玻片放入消毒缸內(nèi)，平板、試管、吸管和廢棄的生化微量管應(yīng)放在指定地點待滅菌處理，不得隨意亂放或清洗。四、認(rèn)真、及時、實事求是地做好實驗記錄，對于當(dāng)時不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實驗，則需記下每次觀察的現(xiàn)象和結(jié)果。注意獨立思考解決實驗中遇到的問題。五、

11、實驗過程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險，應(yīng)先關(guān)掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時用滅火機。六、每次實驗需進行培養(yǎng)的材科，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點進行培養(yǎng)。實驗室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。七、離開實驗室前，先用消毒液泡手，再用肥皂洗手，并用清水沖凈。打掃好實驗室，并注意關(guān)好門窗、水電。實驗一 普通光學(xué)顯微鏡（一）實驗?zāi)康牧私馄胀ü鈱W(xué)顯微鏡基本構(gòu)造及原理，掌握顯微鏡的操作使用。（二）實驗原理普通光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器。以往最簡單的顯微鏡僅由幾塊透鏡組成，而當(dāng)前使用的顯微鏡由一套透鏡組成。普通光學(xué)顯微鏡通常能將物體放大15

12、002000倍。1.顯微鏡的構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造可分為兩大部分：一為機械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。2.顯微鏡的機械裝置顯微鏡的機械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、推動器、粗動螺旋、微動螺旋等部件（1）鏡座  鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學(xué)放大系統(tǒng)部件的基礎(chǔ)。（2）鏡筒  鏡筒上接接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉(zhuǎn)換器下）間的暗室。從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機械筒長。因為物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而

13、且成像質(zhì)量也受到影響。因此，使用顯微鏡時，不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)筒長定為160mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡的外殼上。（3）物鏡轉(zhuǎn)換器  物鏡轉(zhuǎn)換器上可安裝34個接物鏡，一般是三個接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個物鏡。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中的任何一個接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的接目鏡構(gòu)成一個放大系統(tǒng)。（4）載物臺  載物臺中央有一孔，為光線通路。在臺上裝有彈簧標(biāo)本夾和推動器，其作用為固定或移動標(biāo)本的位置，使得鏡檢對象恰好位于視野中心。（5）推動器  是移動標(biāo)本的機械裝置，它是由一橫一縱兩個推進齒軸的金屬架構(gòu)成的，好的顯微鏡在縱

14、橫架桿上刻有刻度標(biāo)尺，構(gòu)成很精密的平面座標(biāo)系。如果我們須重復(fù)觀察已檢查標(biāo)本的某一部分，在第一次檢查時，可記下縱橫標(biāo)尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動推動器，就可以找到原來標(biāo)本的位置。（6）粗動螺旋  粗動螺旋是移動鏡筒調(diào)節(jié)接物鏡和標(biāo)本間距離的機件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標(biāo)本。新近出產(chǎn)的顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時，右手向前扭載物臺上升，讓標(biāo)本接近物鏡，反之則下降，標(biāo)本脫離物鏡。（7）微動螺旋  用粗動螺旋只可以粗放的調(diào)節(jié)焦距，要得到最清晰的物象，需要用微動螺旋做進一步調(diào)節(jié)。微動螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒移動0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡的粗動螺旋和微動

15、螺旋是共軸的。3.顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像 。（1）反光鏡  較早的普通光學(xué)顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標(biāo)本。不用聚光器時用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線的作用。用聚光器時，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，可通過調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強度。（2）聚光器  聚光器在載物臺下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成的。聚光器可分為明視場聚光器和暗視場聚

16、光器。普通光學(xué)顯微鏡配置的都是明視場聚光器，明視場聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數(shù)值孔徑高于0.6時會顯示出色差和球差。齊明聚光器對色差、球差和慧差的校正程度很高，是明視場鏡檢中質(zhì)量最好的聚光器，但它不適于4倍以下的物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡（4×）大視場照明的需要。聚光器安裝在載物臺下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到最強的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調(diào)節(jié)，使焦點落在被檢物體上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦點在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺平面下方0.1mm。因此，要

17、求使用的載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡的數(shù)值孔徑時，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時，通過虹彩光圈的調(diào)節(jié)再把視場光闌（帶有視場光闌的顯微鏡）開啟到視場周緣的外切處，使不在視場內(nèi)的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。（3）物鏡  安裝在鏡筒前端轉(zhuǎn)換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體第一次造像，物鏡成像的質(zhì)量，對分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apea

18、ture簡寫為NA），每個物鏡的數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。物鏡的種類很多，可從不同角度來分類：根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：干燥系物鏡  以空氣為介質(zhì)，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。油浸系物鏡  常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×100×，數(shù)值孔值大于1。根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：低倍物鏡  指1×6×，NA值為0.040.15；中倍物鏡  指6×25×，NA值為0.15 0.40；高倍物鏡 

19、; 指25×63×，NA值為0.350.95；油浸物鏡  指90×100×，NA值為1.251.40。根據(jù)物鏡像差校正的程度來分類可分為：消色差物鏡  是最常用的物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成的色差。鏡檢時通常與惠更斯目鏡配合使用。復(fù)消色差物鏡  物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍、綠三色光的色差外，還能校正黃色光造成的相差，通常與補償目鏡配合使用。特種物鏡  在上述物鏡基礎(chǔ)上，為達到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無應(yīng)變物鏡

20、，無罩物鏡，長工作距離物鏡等。目前在研究中常用的物鏡還有：半復(fù)消色差物鏡（FL），平場物鏡(Plan)，平場復(fù)消色差物鏡（Plan Apo）,超平場物鏡（Splan，超平場復(fù)消色差物鏡（Splan Apo）等。（4）目鏡  目鏡的作用是把物鏡放大了的實像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結(jié)構(gòu)較物鏡簡單，普通光學(xué)顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場鏡”。上下透鏡之間或在兩個透鏡的下方，裝有由金屬制的環(huán)狀光闌或叫“視場光闌”，物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面處，所以其上可安置目鏡測微尺。普通光學(xué)顯微鏡常用的目鏡為惠更斯目鏡（Huyge

21、ns eyepiece），如要進行研究用時，一般選用性能更好的目鏡，如補償目鏡（K）、平場目鏡（P）、廣視場目鏡（WF）。照相時選用照相目鏡（NFK）。4.光學(xué)顯微鏡的成像原理顯微鏡的放大是通過透鏡來完成的，單透鏡成像具有像差，影響像質(zhì)。由單透鏡組合而成的透鏡組相當(dāng)于一個凸透鏡，放大作用更好。是顯微鏡的成像原理模式。AB為標(biāo)本    5.顯微鏡的性能顯微鏡分辨能力的高低決定于光學(xué)系統(tǒng)的各種條件。被觀察的物體必須放大率高，而且清晰，物體放大后，能否呈現(xiàn)清晰的細微結(jié)構(gòu)，首先取決于物鏡的性能，其次為目鏡和聚光鏡的性能。（1）數(shù)值孔徑 也叫做鏡口率（或開口率），簡寫為N.

22、A，在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。數(shù)值孔徑可用下式表示：N.A=n.sin2式中：n物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)析射率物鏡的鏡口角所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度。鏡口角總是小于180°。因為空氣的折射率為1，所以干燥物鏡的數(shù)值孔徑總是小于1，一般為0.050.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒，則數(shù)值孔徑最大可接近1.5。雖然理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用

23、浸沒介質(zhì)的折射率，但實際上從透鏡的制造技術(shù)看，是不可能達到這一極限的。通常在實用范圍內(nèi)，高級油浸物鏡的最大數(shù)值孔徑是1.4。幾種物質(zhì)的介質(zhì)的折射率如下：空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。介質(zhì)折射率對物鏡光線通路的影響見。（2）分辨力D可用下式表示：D=/2N.A.可見光的波長為0.40.7微米，平均波長為0.55微米。若用數(shù)值孔為0.65的物鏡，則D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。這表示被檢物體在0.42微米以上時可被觀察到，若小于0.42微米就不能視見。如果使用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，則D=2.20微米。凡被檢物體長度大于這個

24、數(shù)值，均能視見。由此可見，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根據(jù)上式，可通過：（1）減低波長；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來提高分辨力。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來提高分辨力以檢視較小的物體的。物鏡分辨力的高低與造象是否清楚有密切的關(guān)系。目鏡沒有這種性能。目鏡只放大物鏡所造的象。（3）放大率顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過物鏡第一次放大造象，目鏡在明視距離造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物體兩者體積大小之比例。因此，顯微鏡的放大率（V）等于物鏡放大率（V1）和目鏡放大率（V2）的乘積，即：V=V1×V2比較精確的計算方法，可從下列公式求得M=×DF

25、1F2F1=接物鏡焦距，F(xiàn)2=接目鏡焦距  =光學(xué)筒長，D=明視距離（=250毫米）=接物鏡的放大倍數(shù)D=接目鏡放大倍數(shù)M=顯微鏡放大倍數(shù)F1F2設(shè)=160毫米   F1=4毫米  D=250毫米  F2=150毫米則M=×D=160×250=40×16.7=668倍F1F2415（4）焦深在顯微鏡下觀察一個標(biāo)本時，焦點對在某一象面時，物象最清晰，這象面為目的面。在視野內(nèi)除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見模糊的物象，這兩個面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深和數(shù)值孔徑及放大率成反比：即數(shù)值孔徑和放大率愈大，焦深愈

26、小。因此調(diào)節(jié)油鏡比調(diào)節(jié)低倍鏡要更加仔細，否則容易使物象滑過而找不到。6.顯微鏡的使用操作及注意事項顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時必須細心，要按下述操作步驟進行。（1）觀察前的準(zhǔn)備1.顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運到實驗桌上。2.將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。3.調(diào)節(jié)光照 不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡，使視野的光照達

27、到最明亮最均勻為止。光線較強時，用平面反光鏡，光線較弱時，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強弱。4.調(diào)節(jié)光軸中心 顯微鏡在觀察時，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內(nèi)接，說明光線已經(jīng)合軸。（2）低倍鏡觀察  鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣

28、。因為低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將標(biāo)本片放置在載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺），直至物像出現(xiàn)，再用細調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。（3）高倍鏡觀察  在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適

29、中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察。（4）油鏡觀察  油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時要特別細心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。使用油鏡按下列步驟操作：1.先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。2.在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。3.從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油

30、中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。4.從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。5.觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，（注意向一個方向擦拭）。6.將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降

31、下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。實驗二 相差顯微鏡（一）實驗?zāi)康牧私庀嗖铒@微鏡基本構(gòu)造及原理，掌握相差顯微鏡的操作使用。（二）實驗原理1.相差顯微鏡的特點 相差顯微鏡是一種將光線通過透明標(biāo)本細節(jié)時所產(chǎn)生的光程差（即相位差）轉(zhuǎn)化為光強差的特種顯微鏡。光線通過比較透明的標(biāo)本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化。因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細胞）時，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標(biāo)本時，直射光和衍射光的

32、光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會發(fā)生改變（產(chǎn)生相位差）。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置環(huán)狀光闌和相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強，使我們能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內(nèi)的某些細微結(jié)構(gòu)。2.相差顯微鏡的成像原理 鏡檢時光源只能通過環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經(jīng)聚光器后聚成光束，這束光線通過被檢物體時，因各部分的光程不同，光線發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點平面和相板上

33、的共軛面重合。因此，未發(fā)生偏斜的直射光便通過共軛面，而發(fā)生偏斜的衍射光則經(jīng)補償面通過。由于相板上的共軛面和補償面的性質(zhì)不同，它們分別將通過這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強度的減弱，兩組光線再經(jīng)后透鏡的會聚，又復(fù)在同一光路上行進，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時，通過無色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)化為人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。3.相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和裝置  相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是相同的，所不同的是它具有四部分特殊結(jié)構(gòu)：即環(huán)狀光闌、相板、合軸調(diào)節(jié)望遠鏡及綠色濾光片。（1）環(huán)狀光闌  具有環(huán)形開孔的光闌。位于

34、聚光器的前焦點平面上，光闌的直徑大小是與物鏡的放大倍數(shù)相匹配的，并有一個明視場光闌，與聚焦器一起組成轉(zhuǎn)盤聚光器。在使用時只要把相應(yīng)的光闌轉(zhuǎn)到光路即可。（2）相板  位于物鏡內(nèi)部的后焦平面上。相板上有兩個區(qū)域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補償面”。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常以“Ph”字樣標(biāo)在物鏡外殼上。相板上鍍有兩種不同的金屬膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常為鉻、銀等金屬在真空中蒸發(fā)而鍍成的薄膜，它能把通過的光線吸收掉60%93%，相位膜為氟化鎂等在真空中蒸發(fā)鍍成，它能把通過的光線相位推遲1/4波長。根據(jù)需要，兩種膜有不同的鍍法，從而制造出不同類型的相差物鏡。如果吸

35、收膜和相位膜都鍍在相反的共軛面上，通過共軛面的直射光不但振幅減弱，而且相位也被推遲1/4，衍射光因通過物體時相位也被推遲1/4，這樣就使得直射光與衍射光維持在同一個相位上。根據(jù)相長干涉原理，合成光等于直射光與衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通過被檢物體的合成光就比背景明亮。這樣的效果叫負(fù)相差，鏡檢效果是暗中之明。如果吸收膜鍍在共軛面，相位膜鍍在補償面上，直射光僅被吸收，振幅減少，但相位未被推遲，而通過補償面的衍射光的相位，則被推遲了兩個1/4，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2。根據(jù)相消干涉原理，這樣通過被檢物體的合成光要比背景暗，這種效果叫正相差，即鏡檢效果是明中之暗。負(fù)相

36、差物鏡（Negativecontrast）用縮寫字母“N”表示，正相差物鏡（Positive  contrast）用縮寫字母“P”表示，由于吸收膜對通過它的光線的透過率不同，可分為高、中、低及低低，如Olympus光的透過率分為：7%、15%、20%、40%四個等級，因此分為高（High略寫為H），中（Medium略寫為M），低（Low略寫為L）及低低（LowLow略寫成LL）四類，構(gòu)成了負(fù)高（NH）、負(fù)中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四種類型相差物鏡，這些字母符號都寫在相差物鏡的外殼上。可根據(jù)被檢物體的特性來選擇使用不同類型的相差物鏡。（3）合軸調(diào)節(jié)望遠鏡  是

37、相差顯微鏡一個極為重要的結(jié)構(gòu)。環(huán)狀光闌的像必須與相板共軛面完全吻合，才能實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。否則應(yīng)被吸收的直射光被泄掉，而不該吸收的衍射光反被吸收，應(yīng)推遲的相位有的不能被推遲，這樣就不能達到相差鏡檢的效果。由于環(huán)狀光闌是通過轉(zhuǎn)盤聚光器與物鏡相匹配的，因而環(huán)狀光闌與相板常不同軸。為此，相差顯微鏡配備有一個合軸調(diào)節(jié)望遠鏡（在鏡的外殼上標(biāo)有“CT”符號），用于合軸調(diào)節(jié)。使用時撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，旋轉(zhuǎn)合軸調(diào)節(jié)望遠鏡的焦點，便能清楚看到一明一暗兩個圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個調(diào)節(jié)鈕，使明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與暗的相板上共軛面暗環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大，可調(diào)節(jié)聚光器

38、的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后取下望遠鏡，換上目鏡即可進行鏡檢觀察。（4）綠色濾光片  由于使用的照明光線的波長不同，常引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調(diào)整光源的波長。Olympus廠家生產(chǎn)的相差顯微鏡在鏡檢時要使用該廠規(guī)定的IF550綠色濾光片作為配套器件。4.相差顯微鏡的使用范圍、操作步驟及注意事項（1）使用范圍  相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細節(jié)，適用于對活體細胞生活狀態(tài)下的生長、運動、增殖情況及細微結(jié)構(gòu)的觀察。因此，是微生

39、物學(xué)、細胞生物學(xué)、細胞和組織培養(yǎng)、細胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必備工具。（2）操作步驟 根據(jù)觀察標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。將標(biāo)本片放到載物臺上。進行光軸中心的調(diào)整。取下一側(cè)目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合，然后取下合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，換回目鏡。在使用中，如需要更換物鏡倍數(shù)時，必須重新進行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。放上綠色濾光片，即可進行鏡檢，鏡檢操作與普通光學(xué)顯微鏡方法相同。（3）注意事項視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強。因環(huán)狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。不同型號的光學(xué)部件不能互換使用。

40、載玻片、蓋玻片的厚度應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)，不能過薄或過厚。切片不能太厚，一般以510m為宜，否則會引起其他光學(xué)現(xiàn)象，影響成像質(zhì)量。實驗三  微生物的分離、純化和接種一、微生物的分離、純化 （一）實驗?zāi)康?1.了解微生物分離和純化的原理，2.掌握常用的分離純化微生物的方法 （二）實驗原理 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在

41、固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不

42、同類型的微生物。（三）實驗材料1.培養(yǎng)基  淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。2.溶液或試劑 10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。3.儀器或其它用具 無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細胞計數(shù)板、涂布器等。（四）實驗方法倒平板制備梯度稀釋液涂布（或劃線法）培養(yǎng)挑單菌落保存。1.稀釋涂布平板法（1）倒平板 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷至5560時，高氏I號瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)

43、滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度為30g/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹觯嚬芑蚱靠诒３謱χ鹧?；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。（2）制備土壤稀釋液 稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管

44、中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的土壤溶液，注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換一支試管。 （3）涂布將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6 三管土壤稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置5l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。（4）培養(yǎng)將高

45、氏I號培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37溫室中培養(yǎng)23d。（5）挑菌落將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28和37溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。（6）平板劃線分離法 倒平板 按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實驗日期。 劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板

46、培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。 挑菌落 同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。 結(jié)果判定 （五）實驗思考1.所做涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請分析其原因并重做。2.在三種不同的平板上你分離得到哪些類群的微生物？簡述它們的菌落特征。二、微生物的接種技術(shù)（一）實驗?zāi)康?1.學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)2.建立無

47、菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)（二）實驗原理將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實驗及科學(xué)研究中的一項最基本的操作技術(shù)。無論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實驗結(jié)果就不可靠，影響下一步工作的進行。（三）實驗器材1.器械和用品 酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。2.菌種和培養(yǎng)基菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus&

48、#160;aureus）。培養(yǎng)基：普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。（四）實驗方法斜面接種法液體接種法固體接種法穿刺接種法。1.斜面接種法斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。 通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無菌室、接種柜或超凈工作臺上進行，先點燃酒精燈。將菌種斜面培養(yǎng)基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，應(yīng)斜持試管呈450度角，并能清楚地看到兩個試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕

49、培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動試管棉塞，使其松動，以便接種時易于取出。 右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無菌棉塞。 將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管

50、口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進行培養(yǎng)。2.液體接種法 多用于增菌液進行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同，僅將不同點介紹如下： 由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時，可用接種鉤或接種鏟進行。 由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時，可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)

51、需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。 接種液體培養(yǎng)物時應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。3.固體接種法 普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時按無菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會使接種后含水量加大

52、，影響培養(yǎng)效果。 用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可，但必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆?。一般是先把種子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。4.穿刺接種法 此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種，操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。接種柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時，應(yīng)向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結(jié)果。5.結(jié)果 分別記錄并描繪平板劃線、斜面和半固體接種的微生

53、物生長情況和培養(yǎng)特征。（五）實驗思考1.如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)？請寫出實驗的主要步驟。2.為什么高氏I號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？3.試述如何在接種中，貫徹?zé)o菌操作的原則? 4.以斜面上的菌種接種到新的斜面培養(yǎng)基為例說明操作方法和注意事項。5.試設(shè)計一個實驗，從土壤中分離酵母菌并進行計數(shù)。實驗四 細菌的簡單染色和革蘭氏染色（一）實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。（二）實驗原理用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。

54、因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態(tài)，簡單染色不能辨別細菌細胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類，是細菌學(xué)上最常用的鑒別染

55、色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。（三）實驗器材1.活材料：培養(yǎng)12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養(yǎng)24h的大腸桿菌

56、（Escherichia coli）2.染色液和試劑：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復(fù)紅、二甲苯、香柏油3.器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡（四）實驗方法1.簡單染色（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過

57、火焰2-3次固定（以不燙手為宜）（4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)。2.革蘭氏染色（1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。（2）晾干：與簡單染色法相同。（3）固定，與簡單染色法相同（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1min。（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。（6）媒染：滴加盧哥氏

58、碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無色，立即水洗。（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。（13）實驗完畢后的處理：將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭?？春蟮娜旧Ｆ脧U紙將香柏油擦干凈。（五）實驗思考給出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。（六）注意事項1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如